La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif caractérisée par un état d’hyperactivation du système immunitaire intestinal. Les données cliniques et expérimentales montrent que l’étiologie de la MC serait une réponse immunitaire aberrante à des facteurs environnementaux et/ou infectieux chez un hôte génétiquement prédisposé. Les patients atteints de MC présentent une perméabilité intestinale anormalement élevée pouvant expliquer la stimulation du système immunitaire intestinal par les bactéries et antigènes du microbiote. La muqueuse iléale des patients atteints de MC est anormalement colonisée par des souches de Escherichia coli ayant la propriété d’adhérer et d’envahir les cellules épithéliales intestinales, de survivre et de se multiplier dans les macrophages en entraînant la sécrétion de TNF-α (Tumor Necrosis Factor-alpha). Un pathovar de E. coli associé à la MC et dénommé AIEC pour « Adherent-Invasive E. coli » a été défini. Les souches AIEC adhérent via l’adhésine FimH des pili de type 1 aux résidus mannose de la glycoprotéine CEACAM6, anormalement exprimée au niveau de l’épithélium iléal des patients atteints de MC. Au cours de la maladie, l’inflammation intestinale peut être contrôlée par les traitements médicamenteux ou la chirurgie sans pour autant obtenir de rémission complète et définitive.Le but du travail était d’analyser les conséquences de l’infection par des bactéries AIEC in vivo dans un modèle murin reproduisant l’interaction AIEC/CEACAM6 et de proposer des stratégies pour éliminer ces bactéries de l’intestin. Nous avons montré que les AIEC avaient la capacité d’altérer la fonction de barrière de l’épithélium intestinal chez des souris transgéniques CEABAC10 exprimant CEACAM6. Cette altération est associée à une forte induction de l’expression de la protéine de jonction Claudine-2, comme observée chez les patients atteints de MC. Nous avons ensuite démontré que la levure S. cerevisiae CNCM I-3856 et des produits de levures étaient capables de maintenir l’intégrité de la barrière intestinale des souris en prévenant la colonisation du tractus digestif par les bactéries AIEC. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés au développement de nouvelles molécules antagonistes de l’adhésine FimH. Les thiazolylaminomannosides ont montré un puissant effet inhibiteur de l’adhésion des bactéries AIEC à des cellules épithéliales intestinales. Les heptyl-mannosides sont également de puissants inhibiteurs de l’adhésion des AIEC et leur présentation en multivalence sur des corps polymériques ou des cyclodextrines potentialisent l’effet anti-adhésif. De manière intéressante, certains heptyl-mannosides diminuent fortement la colonisation de l’intestin par les bactéries AIEC et préviennent la colite chez des souris CEABAC10. Toutefois, la multivalence n’apporte pas d’efficacité supplémentaire dans ce contexte. En conclusion, deux stratégies anti-adhésives ont été étudiées : les levures et les mannosides. Elles pourraient être proposées aux patients atteints de MC fortement colonisés par les AIEC afin d’éliminer ces bactéries du tractus digestif pour espérer diminuer l’inflammation. Les perspectives à ce travail seront la mise au point de techniques de détection simples et rapides des personnes colonisées ou susceptibles d’être colonisées par ces souches de E. coli pour cibler la population à traiter par les probiotiques levures et les molécules anti-adhésives. / Crohn’s disease (CD) is an inflammatory bowel disease (IBD) with a multifactorial etiology, resulting from an exacerbated inflammatory response to intestinal microbes and/or microbial components in genetically susceptible hosts. CD patients present an increased intestinal permeability which can favor the overstimulation of the intestinal immune system by bacteria or antigens from microbiota. Ileal mucosa from CD patients is abnormally colonized by Escherichia coli strains sharing the ability to adhere to and to invade intestinal epithelial cells, to survive and to replicate within macrophages, inducing high secretion of TNF-α (Tumor Necrosis Factor-). These strains associated with CD are grouped in a pathovar of E. coli named AIEC for « Adherent-Invasive E. coli ». AIEC bacteria adhere via the adhesin FimH localized at the tip of the type 1 pili, to mannose residues exposed on the glycoprotein CEACAM6 abnormally expressed at the ileal mucosa of CD patients. Currently, intestinal inflammation can be controlled with drugs or intestinal surgery but total remission cannot be yet achieved. The aim of the present work was to investigate consequences of AIEC infection in a murine model mimicking the AIEC/CEACAM6 interaction and to test different strategies to eradicate these bacteria from the gut. We showed that AIEC bacteria altered barrier function of the intestinal epithelium in transgenic CEABAC10 mice expressing human CEACAM6. The overexpression of the pore-forming tight junction protein claudin-2 was correlated with the increase intestinal permeability, as observed in CD patients. We demonstrated that the yeast strain S. cerevisiae CNCM I-3856, as well as some yeast products, were able to prevent increase of intestinal permeability in decreasing AIEC gut colonization. In a second part, we investigated another strategy targeting AIEC bacteria using antagonists to FimH adhesin. Thiazolylaminomannosides molecules exerted a strong inhibitory effect on the ability of AIEC bacteria to adhere to intestinal epithelial cells. Heptyl-mannosides (HM) also shared high inhibitory properties in vitro and their efficacy can be potentiated when HM are harbored in multiple copies on polymeric or cyclodextrin cores. Interestingly, some HM molecules strongly decreased AIEC gut colonization and the signs of colitis in vivo, in AIEC LF82-infected CEABAC10 mice. In that context, multivalency did not improve inhibitors efficacy.To conclude, two different strategies were studied: probiotic yeasts and anti-adhesive mannosides. These treatments should be proposed in CD patients highly colonized by AIEC bacteria in order to eliminate these bacteria from the gut and to decrease intestinal inflammation. Future works will focus on the development of quick and easy detection methods to determine people colonized or susceptible to be colonized by AIEC bacteria to treat this subpopulation of CD patients.

La maladie de Crohn (MC) est une maladie inflammatoire chronique du tube digestif caractérisée par un état d'hyperactivation du système immunitaire intestinal et évoluant par poussées aigües entrecoupées de périodes de rémission. Les données cliniques et expérimentales montrent que l'étiologie de la MC serait une réponse immunitaire aberrante en réponse à des facteurs environnementaux tels que la consommation de nourriture riche en graisses et en sucres, et infectieux chez un hôte génétiquement prédisposé. Les patients atteints de MC présentent une perméabilité intestinale anormalement élevée, pouvant expliquer la stimulation du système immunitaire intestinal par des bactéries et antigènes de la flore intestinale. La muqueuse iléale des patients atteints de MC est anormalement colonisée par des souches de Escherichia coli ayant la propriété d'adhérer et d'envahir les cellules épithéliales intestinales, de survivre et de se multiplier dans les macrophages en entraînant la sécrétion de TNF-α (Tumor Necrosis factor-alpha). Un pathovar de E. coli associé à la MC et dénommé AIEC pour "Adherent-Invasive E. coli" a été défini. Les souches AIEC utilisent, pour adhérer, la molécule CEACAM6, anormalement exprimée au niveau de l'épithélium iléal des patients atteints de MC. Le travail présenté dans ce document a permis de mettre en évidence la capacité des bactéries AIEC à altérer la fonction de barrière de l'épithélium intestinal dans un modèle de souris transgénique exprimant le récepteur CEACAM6 humain. Cette altération est associée à une forte induction de l'expression de la protéine de jonction Claudine-2, comme observé chez les patients atteints de MC. Une 2ème étude a mis en évidence qu'un régime alimentaire de type occidental entraîne une modification de la composition de la flore intestinale chez les souris CEABAC10 aboutissant à l'apparition d'un micro-environnement inflammatoire favorisant l'implantation des bactéries AIEC et le développement d'inflammation. Enfin, la dernière étude met en évidence les mécanismes de régulation de l'expression du gène CEACAM6 par le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inductible Factor-1), de façon dépendante de la méthylation de l'ADN. L'ensemble de ces travaux a permis de mettre en évidence les conséquences d'une infection par les bactéries AIEC et d'un régime de type occidental sur la fonction de barrière intestinale. / No abstract available

Established biopharmaceuticals such as antibodies and derivatives thereof are relatively large. In cancer therapy, this creates a steep drug concentration gradient within tumors, leaving cells far from blood vessels effectively untreated. Continuous pseudo treatments should foster the development of drug resistance and might lead to eventual disease relapse. Drug concentration gradients can be operationalized as tissue penetration efficiencies, which are functions of molecular size. However, small particles are also subject to potent renal clearance, collapsing the therapeutic window beyond clinical applications. In this master’s thesis, spatial bispecificity was engineered into a single albumin binding domain (ABD). Resulting ABD derived affinity proteins (ADAPTs) are saved from urinary excretion by the grace of HSA, but in the more static microenvironment of tumors, following HSA dissociation, they are capable of tissue penetration efficiencies bestowed only upon smaller particles. To this end, phage display was used to raise ADAPTs against the cancer associated proteins human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) and carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6), but also the inflammation marker C-reactive protein (CRP). Via Sanger sequencing, 9 variants were picked for protein production and characterization, among which two spatially bispecific binders were found. ADAPTs were also evaluated for aggregation tendencies, structural conformity to library design, and thermal stability. One ADAPT, binding HER2, passed all tests of initial characterizations. Deep sequencing was used to analyze selection output, from which many more binders should be screened in future experiments. / Etablerade bioläkemedel liksom antikroppar och deras derivat är relativt stora protein. Som cancerterapeutiska skapar de således branta koncentrationsgradienter utgående från tumörpenetrerande blodkärl. Detta riskerar att lämna vissa cancerceller utanför det terapeutiska fönstret. Det svaga selektionstryck som således verkar i tumörperiferin fostrar cancerceller till att utveckla resistens mot detsamma. Koncentrationsgradienten beror på proteinets vävnadspenetrarande förmåga, vilken är en funktion av proteinets storlek. Mindre proteiner borde därmed lättare ackumuleras i hela tumören och förebygga resistensutveckling. Problemet med små proteiner är deras mycket korta halveringstid i serum, en följd av relativt obehindrad filtrering ut i urinen via njurarna. I det här examensarbetet utvecklades rumsbispecifika bindare av cancerassocierade protein med hjälp av fagdisplayselektioner från ett proteinbibliotek baserat på en enda albuminbindande domän (ABD). Resulterande ABD deriverade affinitetsprotein (ADAPT) undkommer ovan nämnda filtrering tack vare sin naturligt starka interaktion med humant serumalbumin (HSA). I den mer långsamt flödande tumörmikromiljön tillåts ADAPTerna efter albumindissociation sedan utöva en bland bioläkemedel överlägsen vävnadspenetration. Tre parallella selektionsspår utfördes mot de cancerassocierade målproteinerna human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) och carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6 (CEACAM6) samt den utsöndrade inflammationsmarkören C-reaktivt protein (CRP). Via Sangersekvensering kunde flera kandidater identifieras. Bland 6 karakteriserade ADAPTer uppvisade samtliga hög HSA-affinitet, tre konstaterades interagera specifikt med sitt målprotein, och två verkade binda även rumsbispecifikt. ADAPTer utvärderades även för sin benägenhet att bilda aggregat, strukturell överensstämmelse med experimentell design, och värmestabilitet. Endast en bindare, mot HER2, klarade sig genom alla prövningar som proteinkarakteriseringen innebar utan underkänt. Även en högparallel sekvensering utav selektionsresultat utfördes, men utanför de tidsramar som tillät ytterligare karakterisering.