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Previous issue date: 2016-02-22 / CAPES / CNPQ / Heparina imobilizada em suportes sólidos tem sido utilizada como ligante de afinidade em processos de identificação e purificação de diversas proteínas. No presente estudo, foram sintetizados e caracterizados dois diferentes suportes magnéticos: Dacron (polietilenotereftalato) magnético (mDAC) e magnetita revestida com polianilina (MAG-PANI). Esses materiais foram utilizados como suporte para imobilização covalente de heparina e os compósitos magnéticos obtidos foram usados no fracionamento, depleção e purificação de proteínas do plasma humano. Para produzir o suporte mDAC, o Dacron foi tratado com hidrato de hidrazina, formando Dacron-hidrazida, e, em seguida, foi utilizado para formar um compósito com a magnetita, produzida por co-precipitação de sais de ferro II e III. O suporte MAG-PANI foi obtido a partir do revestimento da magnetita (obtida por coprecipitação) com polianilina através da oxidação da anilina pelo permanganato de potássio. Para imobilizar a heparina aos suportes foi necessária a ativação dos seus grupos carboxílicos com carbodiimida (EDAC) e N-hidroxissuccinimida (NHS). Análise por microscopia eletrônica mostrou que mDAC possui um tamanho de 1,5 ± 0,5 μm e 14,4 ± 0,9 nm para MAG-PANI. Difratograma de raio-X indicou a presença do Dacron nas partículas de mDAC e da polianilina em MAG-PANI e em ambos a formação do cristal de magnetita. Além disso, medidas de magnetização demonstraram um comportamento superparamagnético para as duas partículas e uma saturação magnética de 23 e 66 emu/g para mDAC e MAG-PANI, respectivamente, nas temperaturas de 293 K, 300 K e 313 K. A quantidade de heparina imobilizada foi de 51 ± 0,1 e 26,4 ± 0,09 μg de heparina por mg de mDAC e MAG-PANI, respectivamente. Plasma humano foi incubado nos compósitos com heparina imobilizada covalentemente (mDAC-HEP e MAG-PANI-HEP) e posteriormente foram lavados com tampão fosfato com concentrações crescentes de NaCl (0,25; 0,5; 1,0 M). Após esse processo, os eluatos obtidos foram submetidos à eletroforese SDS/PAGE de proteínas. Foram observadas muitas proteínas nas primeiras frações que foram depletadas do plasma (albumina, por exemplo) e as frações obtidas com NaCl 1,0 M demonstraram bandas com peso molecular de 58 kDa que correspondem à antitrombina. Além disso, ao realizar a incubação com a provável antitrombina purificada com o plasma normal, o valor do teste de tromboplastina parcial ativado (TTPa) se mostrou prolongado. Isso ocorreu devido à ação anticoagulante da antitrombina que inibiu a formação da trombina e assim o plasma não coagulou. Sendo assim, o método aqui proposto se mostrou útil como ferramenta de depleção de proteínas plasmáticas e purificação da antitrombina humana apresentando as seguintes vantagens: fácil síntese e separação por afinidade magnética. / Heparin immobilized on solid supports has been used as a ligand in affinity purification processes and identification of several proteins. In the present study, two different magnetic supports were synthesized and characterized: Dacron (polyethylene terephthalate) magnetic (mDAC) and magnetite coated with polyaniline (MAG-PANI). These materials were used as supports for covalent immobilization of heparin and these magnetic obtained composites were used for the fractionation, depletion and purification of human plasma protein. To produce the support mDAC, Dacron was treated with hydrazine hydrate forming Dacron hydrazide, and then was used to form a composite with magnetite produced by co-precipitation of salts iron II and III. MAG-PANI support was obtained from the coating magnetite (obtained by co-precipitation) with polyaniline by oxidation of aniline with potassium permanganate. To immobilize the heparin on the supports it was necessary to activate its carboxyl groups with carbodiimide (EDC) and N-hydroxysuccinimide (NHS). Electron microscopy analysis showed that mDAC has a size of 1.5 ± 0.5 μm and 14.4 ± 0.9 nm for MAG-PANI. X-ray diffraction indicated the presence of Dacron in mDAC particles and polyaniline in PANI-MAG and formation of magnetite crystal in both preparations. Furthermore, magnetization measurements demonstrated a superparamagnetic behavior for the two particles and a magnetic saturation of 23 and 66 emu/g to mDAC and MAG-PANI, respectively, at temperatures of 293 K, 300 K and 313 K. The amount of heparin immobilized was 51 ± 0.1 g and 26.4 ± 0.09 g heparin per mg of mDAC and MAG-PANI, respectively. Human plasma was incubated with the magnetic composites of heparin (mDAC-HEP and MAG-PANI-HEP) that were subsequently washed with phosphate buffer containing increasing concentrations of NaCl (0.25; 0.5; 1.0 M). After this process, the obtained eluates were subjected to electrophoresis SDS/PAGE of proteins. Many proteins were observed in the early fractions that were depleted of the plasma (albumin, for example) and the fractions obtained from 1.0 M NaCl showed bands with a molecular weight of 58 kDa corresponding to antithrombin. Furthermore, by performing incubation with this purified antithrombin from the plasma the value of the activated partial thromboplastin time test (APTT) showed prolonged. Therefore, the proposed method has proven useful as a tool depletion of plasma proteins and purification of human antithrombin having the following advantages: facile synthesis and magnetic affinity separation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufpe.br:123456789/17315 |
| Date | 22 February 2016 |
| Creators | MERCÊS, Aurenice Arruda Dutra das |
| Contributors | CARVALHO JUNIOR, Luiz Bezerra de, MACIEL, Jackeline da Costa |
| Publisher | Universidade Federal de Pernambuco, Programa de Pos Graduacao em Biologia Aplicada a Saude, UFPE, Brasil |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFPE, instname:Universidade Federal de Pernambuco, instacron:UFPE |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazil, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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