Ziel der Arbeit war es, die zellulären Auswirkungen der Anwendung der Herz-Lungen-Maschine histologisch zu untersuchen und zu quantifizieren. Auf der Suche nach Ansätzen für die Kardioprotektion im Rahmen des kardiopulmonalen Bypasses wurden außerdem der Einfluss des Medikaments Minozyklin und des pulsatilen Perfusionsmodus der HLM auf die Gewebeschädigung analysiert. Die Untersuchung erfolgte am Tiermodell des Ferkels.
Die 39 Versuchstiere wurden in fünf Versuchsgruppen eingeteilt: (1) Kontrollgruppe (n=9), (2) Kontrollgruppe mit Minozyklin (n=7), (3) laminare HLM-Gruppe (n=9), (4) laminare HLM-Gruppe mit Minozyklin (n=6) und (5) pulsatile HLM-Gruppe (n=8). Alle Versuchstiere wurden narkotisiert und sternotomiert. Die Tiere der drei HLM-Gruppen (Gruppen 3, 4 und 5) wurden im Anschluss an die Sternotomie kanüliert und an die HLM angeschlossen. Hierbei gab es zwei Versuchsgruppen mit laminarem, kontinuierlichem Flussprofil (Gruppen 3 und 4) und eine Versuchsgruppe mit pulsatilem Perfusionsmodus der HLM (Gruppe 5). Die Dauer der Aortenklemmung betrug 90 min. Für den kardialen Arrest wurde Kardioplegie (Custodiol®, Dr. Franz Köhler Chemie GmbH, Bensheim) verabreicht. Der Eingriff wurde unter hypothermen Bedingungen bei 28°C durchgeführt. Nach Wiedereröffnung der Aorta und Reperfusion wurde nach insgesamt 120 min von der HLM abgegangen. Danach schloss sich eine Rekonvaleszenzzeit von 90 min an. Für die Untersuchung des Effekts von Minozyklin wurde zwei Versuchsgruppen (Gruppen 2 und 4) zu zwei Zeitpunkten Minozyklin verabreicht (1. Gabe nach der Sternotomie 4 mg/kg KG, 2. Gabe nach Abgang von der HLM 2 mg/kg KG). Der Versuch endete mit der Euthanasierung der Versuchstiere und der Organentnahme. Für die immunhistochemische Analyse wurden zelluläre Marker für Hypoxie, Apoptose, nitrosativer zellulärer Belastung und Inflammation untersucht. Für die Beurteilung des Energiehaushalts wurde chromatographisch das Verhältnis aus ATP/ (ADP + AMP) im Myokard bestimmt.
Die laminare HLM führte im Vergleich zur Kontrollgruppe zu einer signifikanten Erhöhung der Expression aller erhobener Parameter. Der mittels HPLC bestimmte Anteil energiereicher Substrate war für die laminare HLM im Vergleich zur Kontrolle signifikant reduziert.
Die Daten für Minozyklin zeigen eine Abschwächung des myokardialen Ischämie- und Reperfusionsschadens im Zuge des Einsatzes der HLM. Die Minozyklin-Gabe resultiert in der signifikanten Reduktion der Expression des Apoptose-induzierenden Faktors (AIF), 3-Nitrotyrosin (NT) und der Poly-(ADP)-Ribose (PAR) im Vergleich zur laminaren HLM-Gruppe ohne Minozyklin. Die zur Verfügung stehenden, energiereichen Phosphate waren für Minozyklin signifikant höher als bei der laminaren HLM.
Für die Pulsation zeigen sich signifikante Effekte auf die Expression der Cleaved Caspase-3 (CC3), NT und PAR im Vergleich zur laminaren HLM. Durch den pulsatilen Perfusionsmodus wurde ebenfalls signifikant das Angebot energiereicher Phosphate im Myokard verbessert.
Die Ergebnisse zeigen, dass die Anwendung des laminaren kardiopulmonalen Bypasses zu einer Myokardschädigung – detektierbar anhand von Markern für Hypoxie, Apoptose, nitrosativer zellulärer Belastung und Inflammation - führt. Minozyklin und Pulsation haben kardioprotektive Eigenschaften hinsichtlich der Ischämie- und Reperfusionsschädigung. Histologisch wurden für beide protektive Ansätze antiapoptotische und antinitrosative Wirkungen nachgewiesen. Minozyklin und der pulsatile Perfusionsmodus verbesserten den Energiehaushalt des Myokards im Vergleich zur konventionellen, laminaren HLM. Alle getroffenen Aussagen sind jedoch aufgrund des angewandten Tiermodells und der geringen Stichprobenzahlen mit Einschränkung zu treffen. Für Minozyklin bleiben Fragen bezüglich der Sicherheit für die Anwendung bei kinderkardiochirurgischen Patienten sowie der Dosierung offen. Mit Blick auf die Pulsation muss betont werden, dass es hier nach wie vor an Leitlinien für die klinische Anwendung in der Kinderkardiochirurgie fehlt. Ebenfalls bleiben die zellulären Effekte des pulsatilen Flussmodus der HLM weitgehend ungeklärt. Weitere präklinische und klinische Studien müssen zeigen, ob Minozyklin und Pulsation zukünftig Eingang in die klinische Anwendung finden.:Abkürzungsverzeichnis
1 EINLEITUNG UND PROBLEMSTELLUNG
1.1 Prinzipien der Herz-Lungen-Maschine
1.1.1 Geschichtlicher Abriss der Entwicklung der Herz-Lungen-Maschine
1.1.2 Indikationen für die Anwendung der Herz-Lungen-Maschine
1.1.3 Aufbau der Herz-Lungen-Maschine
1.1.4 Besonderheiten im Betrieb der Herz-Lungen-Maschine in der
Kinderherzchirurgie
1.2 Pathophysiologische Reaktionen des Körpers auf die
Anwendung der Herz-Lungen-Maschine
1.2.1 Mortalität und postoperative Morbidität im Zusammenhang mit kinderherzchirurgischen Eingriffen
1.2.2 Pathomechanismen der Gewebeschädigung im Zuge der
Anwendung der Herz-Lungen-Maschine
1.3 Protektive Ansätze zur Reduktion schädigender Einflüsse der
Anwendung der Herz-Lungen-Maschine
1.3.1 Systemische Hypothermie
1.3.2 Kardioprotektion
1.3.3 Weitere pharmakologische Ansätze der Organprotektion im
Rahmen des kardiopulmonalen Bypasses
1.3.4 Der Blutflussmodus während des kardiopulmonalen Bypasses
1.4 Problemstellung
2 VERSUCHSTIERE, MATERIALIEN UND METHODEN 24
2.1 Versuchstiere
2.2 Versuchsaufbau
2.3 Versuchsablauf
2.3.1 Anästhesie
2.3.2 Operative Versuchsdurchführung
2.3.3 Intraoperatives Monitoring
2.4 Probenaufbereitung und Paraffineinbettung
2.5 Herstellung der Schnittpräparate
2.6 Immunhistochemie
2.6.1 Negativkontrollen
2.6.2 Entparaffinisierung
2.6.3 Rehydrierung
2.6.4 Immunhistochemische Färbungsprotokolle
2.6.5 Nachbehandlung
2.7 Mikroskopie
2.8 Auswertung
2.9 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2.10 Statistik
3 ERGEBNISSE
3.1 Immunhistochemische Analysen der Auswirkungen der Minozyklin-Gabe und des laminaren versus pulsagilen Blutflusses der Herz-Lungen-Maschine auf myokardiale Zellschädigung und Zelluntergang
3.1.1 Histologische Analyse der Expression des Apoptose-
induzierenden Faktors in myokardialen Zellen
3.1.2 Histologische Analyse der Expression der Cleaved Caspase-3 in myokardialen Zellen
3.1.3 Histologische Analyse der Expression des Hypoxie-induzierten Faktors-1-alpha in myokardialen Zellen
3.1.4 Histologische Analyse der zytosolischen Anreicherung des Substrats Nitrotyrosin in myokardialen Zellen
3.1.5 Histologische Analyse der Anreicherung von Poly-ADP-Ribose in myokardialen Zellen
3.1.6 Histologische Analyse der Expression des Tumornekrosefaktors-alpha in myokardialen Zellen
3.2 Auswirkung von Minozyklin und pulsatilem Flussmodus der Herz-Lungen-Maschine auf den myokardialen Energiehaushalt
4 DISKUSSION
4.1 Modellbetrachtung
4.2 Auswertung der Wirkung von Minozyklin auf die Schädigung des myokardialen Gewebes im Rahmen der Behandlung mittels Herz-Lungen-Maschine
4.3 Vergleich der Effekte des laminaren und pulsatilen Blutflussmodus der Herz-Lungen-Maschine auf die Schädigung des myokardialen Gewebes
5 ZUSAMMENFASSUNG
6 LITERATURVERZEICHNIS
7 ANHANG
7.1 Tabellenverzeichnis
7.2 Abbildungsverzeichnis
7.3 Herstellungsprotokolle
7.3.1 Protokolle für Formalinfixierung und Paraffineinbettung
7.3.2 Protokolle zur Herstellung der Gebrauchslösungen für das histologische Arbeiten
7.3.3 Immunhistochemische Färbungsprotokolle
7.3.4 Protokoll für die High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Eigenständigkeitserklärung
Publikationen
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:74427 |
| Date | 16 April 2021 |
| Creators | Sigusch, Sophie |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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