Orientador: Iscia Lopes-Cendes / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T04:41:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2009 / Resumo: A epilepsia é uma condição bastante freqüente que atinge aproximadamente 1,5% da população geral, sendo mundialmente considerada um problema de saúde pública. O termo epilepsia engloba um grupo de distúrbios neurológicos crônicos com diferentes etiologias, manifestações e prognósticos, mas que possuem como característica comum as crises convulsivas recorrentes. A Epilepsia Mioclônica Juvenil (EMJ) é caracterizada por abalos mioclônicos principalmente ao despertar. A EMJ tem sido uma das formas de epilepsia mais amplamente estudadas do ponto de vista molecular. Recentemente, um dos genes causadores da EMJ foi clonado. Este gene, chamado de EFHC1, codifica uma proteína que possui 640 aminoácidos e que possui três domínios estruturais DM10, de função desconhecida, e um motivo de ligação a cálcio, chamado de EF-hand. A proteína EFHC1 associa-se a microtúbulos e, dessa forma, participa ativamente do processo de divisão celular. Além disso, esta proteína induz apoptose em neurônios através da sua associação com um canal de cálcio voltagem-dependente (Cav2.3). Foram identificadas cinco mutações no gene EFHC1 que co-segregam com o quadro epiléptico em pacientes acometidos por EMJ. As proteínas mutadas codificadas por estas variantes têm a capacidade pró-apoptótica reduzida. Os genes ortólogos de camundongo e rato, chamados de Efhc1, também foram isolados. O gene murino codifica uma proteína de aproximadamente 75KDa, homóloga à proteína Rib72 de Chlamydomonas reinhardtii. A proteína Efhc1 é abundante em tecidos e órgãos que possuem flagelos ou cílios móveis, como, por exemplo, os testículos, os ovidutos e, no sistema nervoso central (SNC), as células ependimárias. No epêndima, a proteína Efhc1 é essencial para a manutenção da freqüência de batimento ciliar destas células. Os principais objetivos desta tese foram a determinação do perfil de expressão do gene Efhc1 e a avaliação da viabilidade de estudos funcionais pela modulação de sua expressão no cérebro de roedores em diferentes estágios de desenvolvimento. Os experimentos de reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real revelaram que não há diferença na expressão do transcrito do gene Efhc1 entre os hemisférios cerebrais nas duas espécies. Os ensaios de Western blot corroboraram este achado. Além disso, os maiores níveis do transcrito destes genes são observados nos estágios intra-uterinos nos camundongos e nos animais adultos em ratos. Em comum, há um decréscimo progressivo na expressão dos genes a partir de neonatos de 1 dia de vida (P1) até P14. Os estudos de hibridização in situ mostraram que o transcrito dos genes Efhc1 destas espécies é expresso nas células ependimárias, as quais revestem as paredes dos ventrículos cerebrais. Estes resultados sugerem que a expressão do gene Efhc1 é mais importante durante as fases iniciais do desenvolvimento do cérebro e que, neste estágio, a proteína Efhc1 pode estar envolvida no surgimento dos mecanismos epileptogênicos subjacentes a EMJ. A técnica de interferência por RNA (RNAi) promove o silenciamento gênico potente e específico e foi utilizada neste projeto com o intuito de estudar a função do gene Efhc1 em células de mamíferos em cultura e no cérebro de camundongos em desenvolvimento. Esta abordagem tem sido amplamente utilizada para esta finalidade. Tanto para os experimentos com cultura celular quanto para os experimentos in vivo, a confirmação do silenciamento gênico ocorreu via Real Time PCR e Western blot. Além disso, foram utilizados controles negativos (injeção apenas com tampão e siRNA irrelevantes). Inicialmente, foram desenhadas e sintetizadas duas moléculas de siRNA, as efetoras da RNAi, que promovem um silenciamento gênico temporário, e uma molécula de shRNA (short hairpin RNA), cujo efeito é duradouro. Nos experimentos com cultura de células, foram utilizados diferentes tipos celulares, desde cardiomiócitos de rato até células de camundongos derivadas de neuroblastoma (Neuro2A). Já para o silenciamento do gene no cérebro de camundongos em desenvolvimento, foram utilizadas diferentes metodologias de inoculação da molécula, como, por exemplo, cirurgia intra-uterina, transfecção hidrodinâmica, injeção na veia jugular e associação do siRNA com um peptídeo derivado de uma glicoproteína do vírus da raiva. Como resultado, obteve-se silenciamento duradouro e consistente do gene Efhc1 em cultura de células Neuro2A. A maior porcentagem de silenciamento gênico (60%) foi obtida após 48h de incubação do siRNA com as células e o gene permaneceu silenciado por até 6 dias. Além disso, o silenciamento do gene Efhc1 no Sistema Nervoso Central de roedores (redução da expressão em até 45%) foi alcançado pela complexação do siRNA com um peptídeo derivado do vírus da raiva, o RVG-9R. Espera-se que os resultados deste estudo sejam capazes de fortalecer a associação do gene
EFHC1 e o fenótipo de EMJ, além de fornecer maiores subsídios para identificar os possíveis mecanismos biológicos envolvidos na fisiopatologia da EMJ, os quais permanecem ainda muito controversos. / Abstract: Epilepsy is a frequent condition that affects around 1.5% of general population and is considered worldwide as a public health problem. The term epilepsy refers to a group of chronic neurological disorders with different etiologies and prognostics. However, a common characteristic of all epilepsies is the recurrence of seizures. Juvenile myoclonic epilepsy (JME), one of the most common forms of epilepsy, is characterized by myoclonic seizures mainly at awakening. JME has been intensively studied at the molecular level. Recently, one of the putative causative genes for JME was cloned. This gene, called EFHC1, encodes a protein with 640 amino acids that has three DM10 domains, with unknown function, and a calcium binding motif, called Ef-Hand. EFHC1 protein associates with microtubules and, therefore, it actively participates in the cellular division process. In addition, it has been demonstrated that this protein induces apoptosis in cultured neurons through the association with an R-type voltage-dependent calcium channel (Cav2.3).To date, five different EFHC1 missense mutations identified in patients with JME were shown to decrease this proapoptotic function in cell models. The ortholog genes in mouse and rat, both named Efhc1, were also isolated. The murine gene encodes a protein with around 75KDa, homolog to Chlamydomonas reinhardtii Rib72 protein. Efhc1 protein presents its highest expression levels in tissues and organs that have mobile cilia and flagella, like testis, oviduct and, in the central nervous system, the ependymal cells. The aim of this study was to determine the distribution and expression profile of Efhc1 genes and evaluate the viability of functional studies by the modulation of the its expression during the development of the brain of mice and rats. Real time polymerase chain reaction (Real Time PCR) revealed that there is no difference in the expression of Efhc1 transcript between right and left hemispheres in both species. Western blot experiments corroborated this finding. In addition, the highest levels of Efhc1 mRNA were found at intra-uterine stages in mouse and in adulthood in rat. In common, there was a progressive decrease in Efhc1 expression from 1-day-old neonates to 14-days-old animals in both species. In situ hybridization studies showed that rat and mouse Efhc1 mRNAs are expressed in ependymal cells of ventricle walls. Our findings suggest that Efhc1 expression is more important during initial phases of brain development and that at this stage it could be involved in key developmental mechanisms underlying JME. The technique of RNA interference (RNAi) promotes a potent and specific gene silence and it was employed in this project to study the function of Efhc1 gene in cultured mammal cells and in the brain of mice in different developmental stages. This approach has been widely used to achieve this aim. Both for cultured cells assays as for in vivo experiments, the percentage of gene silence was evaluated with Real Time PCR and Western blot. In addition, negative controls (injection only with buffer and the use of an irrelevant siRNA) were used in the experiments. Initially, we used two siRNAs, the effectors of RNAi. The siRNA molecules promote a temporary gene silence, whereas the short hairpin RNA (shRNA), another type of molecule, promotes long-term gene silence. In the experiments with mammal cells in culture, we used different cellular types, from rat cardiomyocytes to mouse neuroblastoma cells. For the in vivo experiments, different methodologies were used, such as intra-uterine surgery, hydrodynamic transfection, and association of the siRNA with a peptide derived from a rabies virus glycoprotein. A long-term Efhc1 gene silencing was obtained in Neuro2A cells. The greatest silencing percentage (60%) was observed after 48h of incubation with the siRNA and the gene remained silenced for up to 6 days. Besides, Efhc1 gene silencing in rodent Central Nervous System (decrease in gene expression of 45%) was achieved by the inoculation of the siRNA-RVG-9R complex. We believe that our results point to an association between putative EFHC1 gene function during brain development and the physiopathology of JME. / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/316859 |
| Date | 13 August 2018 |
| Creators | Conte, Fabio Frangiotti |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Lopes-Cendes, Íscia Teresinha, 1964-, Papes, Fabio, Sonatti, Maria de Fatima, Valle, Angela Cristina, Paço-Larson, Maria Luisa |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 109 p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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