Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctora en Farmacología / Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno gástrico humano asociado
al desarrollo de cáncer gástrico. En células epiteliales gástricas, la infección con
H. pylori promueve la activación de diversas vías de señalización asociadas
tanto a la progresión como al arresto del ciclo celular. Por otro lado, H. pylori ha
demostrado inducir los niveles del Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α), un
factor transcripcional relacionado con la expresión de genes necesarios para la
progresión tumoral. Fuera de sus funciones canónicas, se ha descrito que, en el
contexto de la hipoxia, HIF-1α es capaz de promover arresto del ciclo celular en
la fase G1 como parte de una acción no transcripcional. No obstante esto, HIF-
1α puede ser inducido por la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, vía de
señalización relacionada con progresión del ciclo celular que ha sido asociada
también a la acción de H. pylori. Aunque se ha descrito que la infección con H.
pylori promueve la inducción de HIF-1α, actualmente no hay antecedentes
precisos acerca de la vía de señalización precedente a este fenómeno, así
como tampoco de su efecto sobre el destino de las células epiteliales gástricas.
En este trabajo se buscó determinar si HIF-1α representa una transición
desde señales que promueven un progreso del ciclo celular hacia un arresto del
ciclo celular en la infección con H. pylori. En consecuencia, se propuso estudiar
si H. pylori, al activar la vía PI3K/Akt/mTOR, podría llevar a un aumento de los
niveles de HIF-1α y éste, a su vez, llevar a una respuesta de arresto del ciclo
celular. Para estudiar esto, se utilizó un modelo in vitro basado en células
humanas derivadas de cáncer gástrico MKN45 y AGS y la cepa de H. pylori
26695.
Los resultados indican que H. pylori induce un aumento transitorio de
HIF-1α con localización principalmente nuclear. Al inhibir farmacológicamente la
vía PI3K/Akt/mTOR, se obtuvo que la inhibición de PI3K con LY294002 y de mTOR con Rapamicina fueron capaces de prevenir la inducción de HIF-1α por
H. pylori. Al silenciar HIF-1α se obtuvo una reducción del arresto del ciclo
celular en G0/G1 promovido por la bacteria. Consecuente con esto, los niveles
de la proteína ciclina D1, importante para lograr la transición G1/S del ciclo
celular, fueron diminuidos por la infección con H. pylori, sin embargo, esta
diminución fue menos severa en las células que se silenció HIF-1α. En cuanto a
su actividad transcripcional, se observó que al silenciar HIF-1α se previno el
aumento del mRNA de GLUT-1 promovido por H. pylori sólo a tiempos
tempranos de infección, pero éstos no fueron afectados a tiempos mayores. Por
lo demás, el análisis bioinformático mostró que la infección con H. pylori no
incrementó significativamente la expresión de genes blancos clásicos de HIF-1α
en la mucosa antral. Finalmente, al analizar la acción de los componentes
solubles o de la pared de H. pylori sobre la inducción de HIF-1α, se obtuvo que
ninguno de ellos fue capaz de promover este efecto, sólo el contacto directo
entre el patógeno vivo y el hospedero fue necesario para promover un aumento
de los niveles de la proteína.
En resumen, los resultados sugieren que H. pylori promueve un aumento
de HIF-1α a través de la activación de PI3K y mTOR, y que esta inducción
permite el arresto de células gástricas en la fase G0/G1 del ciclo celular.
Además, HIF-1α tendría una participación menor en la expresión de su gen
blanco GLUT-1. Finalmente, los datos sugieren que el factor de virulencia
posiblemente implicado en este fenómeno requiere de la interacción directa
entre H. pylori y la célula gástrica para ejercer su función / Helicobacter pylori (H. pylori) is a human gastric pathogen whose
presence is linked to gastric carcinogenesis. In gastric epithelial cells, H. pylori
infection promotes activation of several signaling pathways associated with both
cell cycle progression and cell cycle arrest. On another hand, H. pylori has been
linked to the induction of Hipoxia Inducible Factor -1α (HIF-1α), a transcription
factor involved in the expression of several genes required for tumor
progression. In addition to its canonical functions, in the context of hypoxia, HIF-
1α has been shown to promote cell cycle arrest in G1 phase as a nontranscriptional
mode of action. HIF-1α induction in normoxia by activation of the
PI3K/Akt/mTOR pathway has been described, and signaling via this pathway
related to cell cycle progression also has been linked to H. pylori infection.
However, although H. pylori reportedly promotes HIF-1α induction, currently little
data is available concerning the signaling pathway(s) by which H. pylori
promotes HIF-1α induction, as well as the consequences of such induction for
cell fate.
In this study, we sought to determine whether HIF-1α mediates the
transition from cell cycle progression to cell cycle arrest observed following H.
pylori infection. Thus, we evaluated whether activation of the PI3K/Akt/mTOR
pathway increases HIF-1α levels and whether this leads to cell cycle arrest. To
do so, these studies employed as in vitro models the human gastric cancer cell
lines MKN45 and AGS as well as the H. pylori 26695 strain.
The results indicate that H. pylori induces transient HIF-1α increases and
enhances nuclear localization of the transcription factor. Pharmacological
inhibiton of the PI3K/Akt/mTOR pathway revealed that the PI3K inhibitor
LY294002 and the mTOR inhibitor Rapamycin precluded H. pylori-enhanced
HIF-1α induction. HIF-1α silencing prevented H. pylori-induced cell cycle arrest in G0/G1 phase. Consequently, cyclin D1, an important protein for G1-S phase
transition, decreased following H. pylori infection, and this decrease was less
dramatic in HIF-1α knockdown gastric cells. With respect to HIF-1α
transcriptional activity, we observed that HIF-1α silencing precluded increases in
GLUT-1 mRNA promoted by H. pylori at early stages of infection only.
Furthermore, bioinformatic analysis revealed that H. pylori infection was not
associated with an increase in the expression of classical HIF-1α target genes in
antral mucosa. Finally, analysis of the contribution of soluble components or
components from the bacterial wall to HIF-1α induction, revealed that none of
them individually were sufficient to promote the effect. Rather, the direct
interaction between live bacteria and gastric cells was neccessary for H. pylori to
increase HIF-1α protein levels.
In summary, the results obtained in this thesis suggest that H. pylori
increases of HIF-1α protein levels in normoxia through PI3K and mTOR
activation, and that this induction promotes cell cycle arrest in the G0/G1 phase.
Furthermore, HIF-1α appears to participate to some extent in modulating the
expression of the target gene GLUT-1. Finally, the putative virulence factor
involved in these events requires the direct interaction between bacteria and the
host cell to exert its effect / Conicyt; Fondecyt; Fondap
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/142383 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Canales Urriola, Jimena Andrea |
| Contributors | Quest, Andrew F. G., Bravo Rodríguez, Denisse |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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