O Ca+2 tem sido relatado como um íon de extrema importância celular. Sua concentração intracelular alterada está relacionada com: (i) a ativação de proteínas importantes, dentre elas as de reparação e de apoptose, (ii) as doenças humanas de grande relevância sócio-econômica e (iii) o aumento dos danos celulares. Sabendo-se que a sua concentração intracelular é responsável pela manutenção da viabilidade celular e frente à importância já conhecida deste íon, esta dissertação teve por objetivo, primeiramente, fazer uma busca sobre os dados existentes na literatura para delinear quais são os possíveis mecanismos moleculares pelo qual o Ca+2 afeta os mecanismos de reparação e apoptose. Esta busca norteou posteriores testes e pesquisas que culminaram nos resultados obtidos e apresentados neste trabalho. Para a realização de alguns testes foi desenvolvida uma nova metodologia, o ensaio Poissoner Quantitative Drop Test (PQDT), a qual permite a análise de sobrevivência de diferentes linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes ou proficientes em determinadas proteínas, frente à exposição crônica a um agente genotóxico. Esta técnica também permite observar efeitos citostáticos e citotóxicos nas células testadas. Além disso, realizou-se uma análise de Biologia de Sistemas das proteínas de S. cerevisiae responsáveis pela homeostase de Ca+2 e encontrou-se uma correlação direta destas com proteínas responsáveis pela reparação de DNA por meio da via de excisão de nucleotídeos ou NER. Uma vez obtidos estes dados, as linhagens de leveduras deficientes nas proteínas tanto de homeostase de Ca+2, Pmr1p, Cod1p, Por1p, como para o gene RAD4 foram construídas. Além dos simples mutantes, foram construídas linhagens duplos mutantes para ambas as vias. Assim, foram realizados ensaios de citotoxicidade, citostaticidade e de parada do ciclo celular frente à exposição ao agente genotóxico 4-NQO. Conforme os resultados obtidos, a homeostase de Ca+2 exerce influência sobre os mecanismos de reparação de DNA, principalmente nas proteínas da via NER, como a Rad4p. As proteínas Pmr1p e Cod1p são as proteínas de homeostase de Ca+2 mais importantes na resposta ao dano celular. Estes resultados propõem que o estresse de retículo endoplasmático e a fosforilação de proteínas de parada de ciclo celular foram os principais processos metabólicos evidenciados nas linhagens de leveduras testadas após a exposição ao agente genotóxico 4-NQO. Os resultados da análise de Biologia de Sistemas e análise ontológica dos genes mostram que existem muitas vias bioquímicas relacionadas com a homeostase de Ca+2. Isso demonstra a importância destes achados e predispõem muitos outros testes para a elucidação completa destas influências. / Submitted by Marcelo Teixeira (mvteixeira@ucs.br) on 2014-05-22T16:41:02Z
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Dissertacao Nadine Paese Poletto.pdf: 2514929 bytes, checksum: e52f9e75c1db5e89a4fbaf0d3b14215f (MD5) / Calcium (Ca2+) has been reported as an important cellular ion. The changes in the intracellular Ca2+ concentrations are related to: (i) the activation of major proteins related to DNA repair and apoptosis; (ii) induction of human diseases; and (iii) increase in cellular damages. Considering that the Ca2+ intracellular concentration is also responsible for the maintenance of cellular viability, the aim of this study was to proceed with a literature data mining to outline the major Ca2+ molecular mechanisms that can affect the cellular activities. This data mining was necessary to define further biological assays described in this work. In this sense, it was developed a new methodology called PDQT, which allows to evaluate the survival of different Saccharomyces cerevisiae strains deficient or proficient for determined proteins in a chronic exposure conditions in the presence of a genotoxic agent. This new method also allows to observe the citotoxic, citostatic, and cell cycle arrests effects induced by a genotoxic agent. Moreover, it was performed a Systems Biology analyses of the major S. cerevisiae Ca2+ homeostasis-associated proteins and it was found a direct association with proteins of the nucleotide excision repair (NER) pathway. The data gathered by Systems Biology analyses were used to construct yeast strains single and double mutants deficient for Ca2+ homeostasisassociated proteins, like Pmr1p, Cod1p, Por1p, and for the NER-associated protein Rad4p. The yeast strains obtained were challenged against the genotoxic agent 4-NQO and citotoxic, citostatic, and cell cycle arrest assays were performed. Taking into account the results, it was observed that Ca2+ homeostasis mechanisms affect the DNA repair pathways, specially the NER proteins like Rad4p. In this sense, both Cod1p and Pmr1p are the most important Ca2+ homeostasis proteins for the damage cellular response. In addition, these results propose that ER stress and the phosphorylation of cell cycle arrest-associated proteins can be the major metabolic processes after 4-NQO exposure. The results obtained by System Biology and gene ontology analyses proved that many biochemical pathways are related to Ca2+ homeostasis, which demonstrate the importance of the results obtained in this work and lead to other studies.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:vkali40.ucs.br:11338/355 |
| Date | 21 November 2008 |
| Creators | Poletto, Nadine Paese |
| Contributors | Bonatto, Diego |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UCS, instname:Universidade de Caxias do Sul, instacron:UCS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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