Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciencias Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Neurociências, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T13:04:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1
279517.pdf: 1662490 bytes, checksum: 19e960469d98f24eb0775fe8b5efcb5d (MD5) / A crista neural (CN) constitui uma população celular pluripotente derivada das pregas neurais da placa neural que surge nos estágios iniciais da embriogênese, durante o processo de neurulação. A CN origina todo o sistema nervoso periférico, pigmentação do corpo além dos ossos e cartilagens crânio-faciais. A deficiência de ácido fólico (AF) promove um aumento nos níveis de homocisteína (HC) e tem sido associada a diversas anomalias congênitas, principalmente a defeitos no fechamento do tubo neural e neurocristopatias. No entanto, os mecanismos celulares desse processo não estão esclarecidos e se são causados pela deficiência de folato ou pelo aumento dos níveis de HC. Desse modo, esse trabalho tem por objetivo investigar o efeito da HC e AF em diversos aspectos da morfogênese da CN, como a migração, proliferação, morte e diferenciação celular. Culturas primárias de células da crista neural (CN) da região cefálica (mesencefálo) foram realizadas a partir de explantes das pregas neurais de embriões murinos de 8,5 dias de gestação. Os explantes foram cultivados sobre substrato de fibronectina (FN) (20µg/mL) em meio de cultura contendo homocisteína (HC) (0, 75, 150 ou 300 uM) e/ou ácido fólico (AF) (45 e 90uM). Após 48 horas, os explantes foram removidos e as células da CN que migraram para a placa de cultivo a partir do tubo neural foram tripisinizadas, replaqueadas e mantidas em cultura por mais 10 dias nas mesmas condições de tratamento. Os fenótipos celulares foram identificados por imunofluorescência utilizando anticorpos para proteínas marcadoras específicas de células gliais (proteína ácida fibrilar glial-GFAP), neurônios (-Tubulina III), células de músculo liso (alfa-actina de músculo liso-aSMA) e células da crista neural indiferenciada (nestina e p75). Foram analisados ainda, a área de migração das células da CN, a proliferação celular por incorporação de BrdU e a proporção de núcleos apoptóticos. Nossos resultados demonstram que a HC reduz a diferenciação da CN para o fenótipo de músculo liso de maneira dosedependente, e aumenta a proporção de células indiferenciadas, não alterando a proporção de células gliais e neurônios. A adição de AF previne esse efeito da HC. A proporção de núcleos apoptóticos manteve-se baixa em todas as condições analisadas, sugerindo que os efeitos observados não se devem a uma morte celular acentuada. Por outro lado, observamos um progressivo aumento na migração e proliferação celular das células da CN após tratamento com concentrações crescentes de HC, efeito este prevenido pela adição de AF. Os resultados sugerem que a HC influencia os processos de diferenciação, migração e proliferação das células da CN podendo assim estar relacionada com o surgimento de anomalias congênitas e que o AF previne esses efeitos. / The neural crest (NC) is a transient structure of the vertebrate embryo formed by the lateral borders of the neural primordium during neurulation. The NC originates most of neurons and glial cells of the peripheral nervous system, pigment cell of body and bones and cartilage of the head. Folic acid (FA) deficiencies lead to an increase in the levelf of homocysteine (HC) and have been associated with many adverse congenital abnormalities, particularly neural tube closure defects and neurocristopathies. However, it is not clear, whether these defects are due to a FA deficiency or to the increased levels of (HC) levels neither the involvement of the NC cells. Thus, the objective of this study was to investigate the effect of HC and AF in various aspects of morphogenesis the CN, such as migration, proliferation, death and cell differentiation. Primary cell cultures were performed by mechanical dissection of neural tubes of 8.5 days post coitum mouse embryos at the level of mesencephalon. Explants were applied on plastic dishes coated with fibronectin (FN) (20ìg/mL), being removed 48 hours later. The remaining migrated cells (NC cells) were then trypsinized, reapplied on the same culture condition and cultured for additional 10 days. Cells were cultured in the complex media containing HC (0, 75, 150 or 300 uM) and/or FA ( 45 or 90uM). The medium was changed every 3 days. The cell phenotypes were identified by immunofluorescence using the ineagespecific markers to glial cells (GFAP), neurons (-III-Tubulin), smooth muscle cells (aSMA), and indiferentiated neural crest cells (nestin and p75). It was also analyzed the NC cell migration area, the cell proliferation (by BrdU incorporation) and the proportion of apoptotic nuclei. We could observe that HC reduces in a dose-dependent manner the differentiation of NC to smooth muscle cells, and increases the proportion of undifferentiated cells, an effect
that is prevented by AF. The proportion of apoptotic nuclei was insignificant in all tested condition, suggesting that massive cell death is not responsible to the observed effects. In addition, we verified that HC progressively increased the migration and proliferation of NC cells, effects prevented by FA. These results suggest an effect of the HC in the differentiation, migration and proliferation processes of the CN cells that may be involved in ongenital
anomalies, and that FA prevent this effects.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufsc.br:123456789/94594 |
| Date | 25 October 2012 |
| Creators | Melo, Fernanda Rosene |
| Contributors | Universidade Federal de Santa Catarina, Trentin, Andrea Gonçalves |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 51 f.| il., grafs., tabs. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSC, instname:Universidade Federal de Santa Catarina, instacron:UFSC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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