Human coronavirus OC43 (HCoV-OC43) is a beta-coronavirus from the coronaviridae family. In contrast to SARS-CoV-2, HCoV-OC43 causes upper respiratory tract disease. However, because of their close phylogenic proximity but distinct pathologies, HCoV-OC43 is a very interesting surrogate to study and compare beta coronaviruses. As all viruses, the latter hijack cell machinery proteins to complete their life cycle. Cellular proteins, particularly those incorporated into virions are of particular interest since they often play a vital role in the virus life cycle. Our goal is to employ the proteomic pipeline we developed for HSV-1 to characterize the host proteins associated with highly purified extracellular HCoV-OC43 particles and finally expand it to SARS-CoV-2. To this end, high purity in sufficient yields is crucial as mass spectrometers pick up contaminants. The proteins present in cell culture medium serum, as well as the proteins carried by the exosomes produced by the cells or by the exosomes present in the cell culture media serum, are of particular concern. We utilized a series of methods to eliminate cell culture serum protein contaminations, enrich the viral particles, and separate exosomes from viral particles. For example, we have obtained an efficient separation of concentrated HCoV-OC43 virions from exosomes using density gradient fractionation. Mass spectrometry results on the purified fractions validated the enrichment of viral particles in the virus fraction and the lack of viral proteins in the mock samples. Most interestingly, we detected 69 host proteins unique to the virus fraction (compared to the mock), mostly regulating the RNA metabolism pathway followed by metabolite interconversion, protein modifying enzymes, and protein-binding activity modulator pathways. Since we also purified extracellular exosomes in the process, we probed whether the virus alters their protein content. Mass spectrometry revealed 51 unique proteins exclusively found in exosomes produced by HCoV-OC43 infected cells. These included translational proteins, metabolite interconversion enzymes, and scaffold proteins. Our preliminary RNA interference studies showed that knocking down 14 of these host proteins altered HCoV-OC43 titers. Studying host-virus protein interactions allows us to gain a deeper understanding of how viruses take advantage of host cells, and how we can develop novel viral therapeutics. / Le coronavirus humain OC43 (HCoV-OC43) est un bêta-coronavirus de la famille des
coronaviridae. Contrairement au SRAS-CoV2, le HCoV-OC43 provoque une maladie des voies
respiratoires supérieures. Cependant, en raison de leur proximité phylogénique étroite mais leur
pathologie distincte, HCoV-OC43 est un substitut fort intéressant pour étudier et comparer les
bêta-coronavirus. Comme tous les virus, ces derniers détournent les protéines de la machinerie
cellulaire pour compléter leur cycle de vie. Les protéines cellulaires, en particulier celles
incorporées dans les virions, sont particulièrement intéressantes puisqu'elles jouent souvent un
rôle vital dans le cycle de vie du virus. Notre objectif est d'utiliser le pipeline protéomique que
nous avons développé pour le HSV-1 afin de caractériser les protéines hôtes associées à des
particules virales extracellulaires de HCoV-OC43 hautement purifiées et d'étendre cette approche
au SRAS-CoV2. À cette fin, une pureté élevée avec des rendements suffisants est cruciale car les
spectromètres de masse détectent les contaminants. Les protéines présentes dans le sérum du
milieu de culture cellulaire, ainsi que les protéines portées par les exosomes produits par les
cellules ou par les exosomes présentes dans le sérum du milieu de culture cellulaire, sont
particulièrement concernées. Nous avons utilisé une série de méthodes pour éliminer les
contaminations par les protéines sériques des cultures cellulaires, enrichir les particules virales et
séparer les exosomes des virus. Nous avons ainsi obtenu une excellente séparation des virions
HCoV-OC43 concentrés des exosomes en utilisant le fractionnement par gradient de densité. Les
résultats de spectrométrie de masse sur les fractions purifiées ont validé l'enrichissement en
particules virales dans la fraction virale et l'absence de protéines virales dans les échantillons
contrôles. Plus intéressant encore, nous avons détecté 69 protéines hôtes uniques à la fraction
virale (par rapport aux cellules non-infectées). Ces protéines sont principalement associées à la
voie du métabolisme de l'ARN suivie de l'interconversion des métabolites, des enzymes modifiant
les protéines et des voies modulatrices de l'activité de liaison aux protéines. Puisque nous avons
séparés les exosomes des virus, nous en avons profiter pour évaluer si le virus altère leur contenu
protéines. La spectrométrie de masse a de facto identifié 51 protéines uniques aux exosomes
produits par les cellules infectées par HCoV-OC43. Celles-ci régulent des voies des protéines
traductionnelles, des enzymes d'interconversion des métabolites et des voies des protéines
d'échafaudage. Nos études préliminaires sur l’interférence ARN ont montré que l’inactivation de
14 de ces protéines hôtes modifiait le titre de HCoV-OC43. L'étude des interactions hôte-protéine
virale nous permet de mieux comprendre comment les virus tirent parti des cellules hôtes et
comment nous pouvons développer de nouvelles thérapies virales.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32371 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Joharinia, Negar |
| Contributors | Lippé, Roger |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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