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Previous issue date: 2018-02-27 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alternative methods are being developed to reduce, refine, and replace (3Rs) animals used in
experiments and have been applied to test the safety of cosmetics and medicines. It is important
to consider the difficulties that Brazil faces with customs and perishability issues that hinder
and even prevent the use of commercially available reconstructed human skin models. The aim
of this work was to develop a reconstructed human skin model (PHR-UFAM) and test its
applicability for cytotoxicity and genotoxicity assays. For this, skins were generated using
permanent human keratinocytes and fibroblasts (embedded in collagen) cells. The quality
control was performed by morphological and immunohistochemical analyses, viability by MTT
test with negative control, and barrier function test. The applicability for genotoxicity assays
was evaluated by micronucleus test, neutral and alkaline comet, and modified comet for
detection of DNA methylation sites with positive controls of each test defined by OECD and
literature. The best condition tested allowed the development of a reconstructed human skin
(PHR-UFAM) with epidermis presenting expression of immunohistochemical markers:
epithelial (cytokeratins) and dermal (vimentin). The model followed quality parameters
(histology, viability, and barrier function) and presented morphological similarity with models
recognized and validated by OECD. The applicability of skin model for genotoxicity assays
demonstrated the effectiveness of the positive controls: Mitomycin C that was able to increase
significantly the micronucleus frequency when tested at concentrations of 1,5 e 3 μg/mL
(3.03% and 3.51%, respectively); Ethylmethanesulfonate caused damage to the DNA when
tested at concentrations of 5 e 10 μM by comet assay in both alkaline (damage index values of
59.3 and 103.7, respectively) and neutral (damage index of 40.7 and 125, respectively) versions;
and 5-azacytidine in the modified comet assay for methylation detection, tested at
concentrations of 0.5, 1 e 1.5 μM showed reduced damage indexes (107.5, 83.1, and 89.3,
respectively). The results were similar to skin models validated by OECD and literature. Thus,
with this work it was possible to develop a reconstructed human skin model composed entirely
of permanent cells. However, further validation studies are required to prove its effectiveness
for cytotoxicity and genotoxicity tests of substances with therapeutic or cosmetic potential. / O desenvolvimento de métodos alternativos in vitro baseia-se no refinamento, redução e
substituição ao uso de animais em experimentação e têm sido desenvolvidos para testar a
segurança de cosméticos e medicamentos. É importante considerar as dificuldades que o Brasil
enfrenta com questões alfandegárias e de perecibilidade que dificultam e até mesmo impedem
a utilização de modelos de pele humana reconstruída disponíveis comercialmente. Este trabalho
teve como objetivo desenvolver um modelo de pele humana reconstruída (PHR-UFAM) in vitro
utilizando células de cultura permanente e testar suas aplicabilidades para ensaios de
citotoxicidade e genotoxicidade. Para isso, as peles foram geradas utilizando queratinócitos e
fibroblastos (embebidos em colágeno) humanos permanentes. O controle de qualidade das peles
foi feito por análise morfológica e imunohistoquímica, a viabilidade pelo teste do MTT com o
controle negativo e teste de função barreira. A aplicabilidade para ensaios de genotocixidade
foi avaliada pelo teste do micronúcleo, cometa em pH alcalino e neutro e cometa modificado
para detecção de sítios de metilação no DNA com os controles positivos de cada teste definidos
pela OECD e pela literatura. A melhor condição testada permitiu o desenvolvimento de uma
pele humana reconstruída (PHR-UFAM) com uma camada epidérmica apresentando expressão
de marcadores imunohistoquímicos epiteliais (citoqueratinas) e dérmico (vimentina). O modelo
atendeu aos parâmetros de qualidade (histologia, viabilidade e função barreira) e apresentou
semelhança morfológica com os modelos reconhecidos e validados pela OECD. A
aplicabilidade para ensaios de genotoxicidade evidenciou efetividade dos controles positivos:
Mitomicina C, que foi capaz de aumentar significativamente a frequência de micronúcleos em
3,03% e 3,51% nas concentrações de 1,5 e 3 μg/mL; Etilmetanossulfonato, que causou dano ao
DNA no modelo de pele quando testado nas concentrações de 5 e 10 μM, avaliado pelo ensaio
do cometa tanto na versão alcalina (índices de dano iguais a 59,3 e 103,7, respectivamente)
quanto na neutra (índices de dano iguais a 40,7 e 125, respectivamente); e 5-azacitidina no
ensaio do cometa modificado para detecção de metilação no DNA testada nas concentrações
0,5, 1 e 1,5 μM, que apresentou índices de dano reduzidos iguais a 107,5, 83,1 e 89,3,
respectivamente, no modelo de pele PHR-UFAM. Os resultados foram comparados com o
controle não tratado. Diante do exposto, com este trabalho foi possível desenvolver um modelo
de pele humana reconstruída composta totalmente de células permanentes semelhante aos
modelos validados e reconhecidos na literatura. Contudo, é necessária a realização de estudos
de validação complementares que comprovem sua efetividade para ensaios de citotoxicidade e
genotoxicidade de substâncias com potencial terapêutico ou cosmético.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:http://localhost:tede/6599 |
| Date | 27 February 2018 |
| Creators | Sousa, Leilane Bentes, 92-98180-5246 |
| Contributors | ppgcf@ufam.edu.br, Vasconcellos, Marne Carvalho de, Montenegro, Raquel Carvalho, Fujimoto, Luciana Botinelly |
| Publisher | Universidade Federal do Amazonas, Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas, UFAM, Brasil, Faculdade de Ciências Farmacêuticas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFAM, instname:Universidade Federal do Amazonas, instacron:UFAM |
| Rights | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/, info:eu-repo/semantics/embargoedAccess |
| Relation | -6425845155986244297, 500 |
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