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Previous issue date: 2008-06-30 / Xylanases have been used in the biobleaching of paper pulps, in bioconversion of
plant biomass, for food and feed industries, among others. For successful selection
of xylanases suitable for specific industrial applications it is important to
characterize enzymes isolated from different sources. The thermophilic fungus
Humicola grisea var. thermoidea is described as a good producer of extracellular
endoxylanases and the Hxyn2 gene from this fungus was isolated and expressed in
yeast Pichia pastoris. The aim of this project was focused on the production,
purification and biochemical characterization of the recombinant HXYN2 (HXYN2r)
enzyme and application on enzymatic hydrolysis of lignocellulosics substrates.
The culture conditions of P. pastoris in flasks, using the 12.3 transformant
and BMMY-U medium, were optimized and the best xylanolytic activity was
478.2 U/mL after 96 h, with a protein concentration of 100 mg/L, using
2.34% (w/v) of nitrogen sources (yeast extract plus urea 1.34:1.0% - w/v),
1% (v/v) of methanol, and OD600 of 10. The HXYN2r enzyme was purified by gel
filtration chromatography with a yield of 6.4% and showed optimum pH and
temperature values of 6.5 and 60ºC, respectively, maintaining 100% of initial
activity after 4 h of incubation at pH 5.5, 6.5 and 7.5. The half-life time was 18 min
at 60ºC and the enzyme was 100% stable after 3 h of incubation at 50ºC. Km and
Vmax values were 7.9 mg/mL e 235.4 μmol/(mL.min), respectively. The HXYN2r
enzyme were used on the enzymatic hydrolysis of sugarcane bagasse (SCB), corn cob (CC) and foliar sample of sugarcane (FSC) alone or with the enzymes of
xylanolytic and cellulolytic system produced by H. grisea fungus. For enzymatic
hydrolysis experiments, the substrates were milled and pretreated with
0.25% (w/v) of H2SO4 by 30 min. On the enzymatic hydrolysis the best conversion
yield of hemicellulosic fractions were obtained using PpHXYN2r supplemented
with EHg: 42.8% to CC, 9.6% to SCB and, a mean of 20% to foliar samples. / As endoxilanases têm sido utilizadas no biobranqueamento da polpa de papel, na
bioconversão da biomassa de plantas, nas indústrias alimentícias e de ração
animal, entre outras. Para a seleção de endoxilanases que possam ser empregadas
em processos industriais específicos é importante caracterizar enzimas isoladas
de diferentes fontes. O fungo termofílico Humicola grisea var. thermoidea é um
bom produtor de endoxilanases extracelulares e o gene que codifica uma das
endoxilanases (HXYN2) deste fungo foi isolado e expresso na levedura
Pichia pastoris. O presente trabalho se concentrou na produção, purificação e
caracterização bioquímica da endoxilanase recombinante HXYN2 e na sua aplicação
na hidrólise enzimática de substratos lignocelulósicos. As condições de cultivo da
levedura P. pastoris em frascos, utilizando o transformante 12.3 e o meio BMMY-U
foram otimizadas e obteve-se uma atividade xilanolítica de 478,2 U/mL após 96 h
de cultivo, com uma concentração de 100 mg/L de proteínas, utilizando
2,34% (p/v) de fontes de nitrogênio (extrato de levedura e urea 1,34:1,0% -
p/v), 1% (v/v) de metanol e DO600 de 10. A enzima HXYN2r foi purificada por
cromatografia de filtração em gel com um rendimento de 6,4% e apresentou pH e
temperatura ótimos de 6,5 e 60ºC, respectivamente, mantendo 100% da atividade inicial após 4 h de incubação nos pH s 5,5, 6,5 e 7,5. O tempo de meia-vida foi de
18 min a 60ºC e a enzima manteve 100% da atividade após 3 h de incubação
a 50ºC. Os valores de Km e Vmáx foram 7,9 mg/mL e 235,4 μmol/(mL.min),
respectivamente. A enzima HXYN2r foi aplicada na hidrólise enzimática de sabugo
de milho (SM), bagaço de cana-de-açúcar (BCA) e palha de cana-de-açúcar (PCA)
sozinha ou em conjunto com as enzimas do sistema xilanolítico e celulolítico
produzidas pelo fungo H. grisea. Para os experimentos de hidrólise enzimática os
substratos testados foram moídos e submetidos a uma etapa de pré-tratamento
com 0,25% (p/v) de H2SO4 por 30 min. Nos ensaios de hidrólise enzimática as
melhores taxas de conversão da fração hemicelulósica dos substratos foram obtidas
utilizando-se a PpHXYN2r suplementado com o EHg: 42,8% para o SM; 9,6% para
o BCA e, em média 20% para as amostras foliares.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.bc.ufg.br:tde/1564 |
| Date | 30 June 2008 |
| Creators | CARVALHO, Wagner Rodrigues de |
| Contributors | FARIA, Fabrícia Paula de |
| Publisher | Universidade Federal de Goiás, Doutorado em Medicina Tropical, UFG, BR, Ciências da Saúde |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFG, instname:Universidade Federal de Goiás, instacron:UFG |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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