Einleitung
Zytokine bewirken maßgeblich die Kommunikation und Koordination der zellulären und humoralen Effektorsysteme der angeborenen und erworbenen Immunität. Die Immunzellen stellen selbst die Hauptproduzenten der Zytokine dar. Pro- und anti-inflammatorische Zytokine nehmen nicht nur innerhalb der Zellkommunikation ablaufender Immun- und Entzündungsreaktionen eine Schlüsselrolle ein, sondern sind somit ebenso am Ablauf von Pathogenesen zahlreicher Erkrankungen beim Pferd beteiligt. Trotz verschiedener Studien anhand unterschiedlicher Modelle existiert keine einheitliche Datenlage zu validierten, vergleichbaren in vivo-nahen Zellkultursystemen, die es erlauben die Kinetiken equiner Zytokine als Grundlage zur weiterführenden Erforschung von Zytokinwechselwirkungen sowie zur Testung potentieller Arzneimittel abzubilden. Aktuell werden insbesondere Glukokortikoide weiterhin aufgrund ihrer anti-inflammatorischen und immunmodulatorischen Eigenschaften häufig, aber in Bezug auf Zytokine unspezifisch zur Therapie equiner Erkrankungen eingesetzt.
Ziele der Untersuchung
Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, eine einfache, schnelle, günstige und reproduzierbare Methodik zur ex vivo-Messung von Zytokinen (Tumornekrosefaktor-alpha [TNF-α], Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist [IL-1Ra] und Interferon gamma [IFN-γ]) und deren zeit- und konzentrationsabhängige Freisetzung in der equinen Vollblutzellkultur zu entwickeln. Anhand dessen sollte weiterführend der Effekt der Glukokortikoide Dexamethason (DEX) und Hydrocortison (HC) auf die Produktion von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ im equinen Vollblut untersucht werden. Zurzeit sind Zytokine, ihre Freisetzung sowie das Eintreten ihrer vermittelten Effekte Gegenstand der gegenwärtigen Forschung, mit dem Ziel spezifische Wechselwirkungen aufzuzeigen und somit zielgerichtete Therapeutika etablieren zu können. Insbesondere Pferde, die eine Anfälligkeit gegenüber mit Sepsis einhergehenden Erkrankungen oder für equines Asthma aufweisen, könnten davon profitieren.
Material und Methoden
Hierfür wurde Pferdevollblut, in den Verdünnungen zu 10%, 20% und 50% eingesetzt und mit Lipopolysaccharid (LPS), einer Kombination aus Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed-Mitogen und LPS (PCPwL) oder equinem rekombinantem TNF-a (erTNF-α) zur Zytokinfreisetzung stimuliert. Zur Erstellung der Zytokinkinetiken wurden Zellkulturüberstände zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und die Konzentrationen von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ mit spezifischen enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) analysiert. In weiterführenden Versuchen wurden in der etablierten equinen Vollblutzellkultur DEX und HC in Konzentrationen von 10-12 - 10-5 M eingesetzt, um die LPS- oder PCPwL- induzierte Zytokinfreisetzung zu modulieren. Statistische Analysen erfolgten über die Berechnungen der Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardfehlern. Signifikanzen wurden über ein- und zweifaktorielle ANOVA bestimmt.
Ergebnisse
Die durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass die optimale Detektion der Zytokine in equinen Vollblutzellkulturen mit einem Blutanteil von 20% durchgeführt werden kann. TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ wurden zeitabhängig freigesetzt und zeigten unterschiedliche Freisetzungskinetiken. Die PCPwL- induzierte TNF-α- und IL-1Ra-Freisetzung stiegen jeweils kontinuierlich über 24 - 48 Stunden an. In ähnlicher Weise erreichte die LPS- stimulierte TNF-α-Konzentration ein Maximum zu Zeitpunkten zwischen 8 - 12 Stunden und begann daraufhin abzufallen, wohingegen die Konzentration von IL-1Ra 24 Stunden später gipfelte und vielmehr fortgeführt über 48 Stunden hinaus akkumulierte. Equines rekombinantes TNF-α konnte ebenso die IL-1Ra-Freisetzung induzieren. Die PCPwL-induzierte IFN-γ-Freisetzung begann zeitversetzt und verlief kontinuierlich ansteigend über 48 - 72 Stunden. In weiterführenden konzentrationsabhängigen Untersuchungen konnte anhand der equinen Vollblutzellkultur eine stärkere Suppression der LPS-induzierten TNF-α- und IL-1Ra-Produktion sowie der PCPwL-induzierten IFN-γ-Produktion durch DEX als durch HC nachgewiesen werden. DEX hemmte die Zytokinfreisetzung mit einer mittleren inhibitorischen Konzentration (IC50) von 0,09 μM (TNF-α), 0,453 μM (IL-1Ra) und 0,001 μM (IFN-γ), während HC IC50 Werte von 1,45 μM (TNF-α), 2,96 μM (IL-1Ra) und 0,09 μM (IFN-γ) aufwies.
Schlussfolgerungen
Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass sich das Model der equinen Vollblutzellkultur hervorragend eignet, um nach erfolgreicher Mitogenstimulation den zeitabhängigen Freisetzungsverlauf von Zytokinen evaluieren zu können. Somit bietet das Model der equinen Vollblutzellkultur durch die Vorteile einer einfachen, günstigen Durchführung im in vivo-nahen, physiologischen Milieu, die Möglichkeit den Zytokinstatus gesunder sowie kranker Pferde zu beurteilen und stellt seinen Nutzen und die Verlässlichkeit unter Beweis potentielle Arzneimittel und immunologische Zusammenhänge des Pferdes untersuchen zu können.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS III
TABELLENVERZEICHNIS III
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 3
2.1 Allgemeine wissenschaftliche Hintergründe 3
2.1.1 Das Blut und das Immunsystem des Pferdes 3
2.1.1.1 Zusammensetzung des equinen Blutes 3
2.1.1.2 Allgemeiner Aufbau des Immunsystems 4
2.1.2 Zytokine und Entzündungsreaktionen - Mediation der Immunantwort durch Zytokine und Chemokine 14
2.1.2.1 Pro-inflammatorische Zytokine: Tumornekrosefaktor-α und Interferon-γ 17
2.1.2.2 Anti-inflammatorische Zytokine: Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist 19
2.2 Therapeutische Beeinflussung der Zytokin- und Mediator-Freisetzung 21
2.2.1 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch Glukokortikoide 21
2.2.2 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch weitere Pharmaka und Substanzen 23
2.2.2.1 NSAID 23
2.2.2.2 Small molecules und Anti-Zytokinantikörper 24
2.3 Equine Zellkulturmodelle zur Zytokindetektion 25
2.3.1 Stimulation der Zytokinfreisetzung 26
2.3.2 Vollblutzellkultursysteme und Systeme mit isolierten Zellen 27
2.4 Fragestellung der Dissertation 30
3 PUBLIKATIONEN 31
3.1 Freisetzungskinetik von TNF-α und IL-1Ra im equinen Vollblut 32
3.2 Modulation der Freisetzung von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur durch Glukokortikoide 40
4 DISKUSSION 45
4.1 Zytokinfreisetzung im equinen Vollblut 46
4.2 Der Einfluss von Glukokortikoiden auf die Zytokinfreisetzung 52
4.3 Schlussfolgerungen 56
4.4 Ausblick 56
5 ZUSAMMENFASSUNG 58
6 SUMMARY 60
7 LITERATURVERZEICHNIS 62
8 ANHANG 72
8.1 Freisetzungskinetik von IFN-γ 72
8.2 Konzentration von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur 72
9 DANKSAGUNG 74 / Introduction
The communication and coordination between the cellular and humoral effector compartments of the innate and adaptive immunity were mainly accomplished by cytokines. Immunocompetent cells themselves represent the main source for cytokines. Pro- and anti-inflammatory cytokines not only play a pivotal role within the cell signaling of expiring immune- and inflammatory reactions but also take part in the pathogenesis of several equine diseases. Despite various studies based on different experimental setups no uniform availability of data about validated, comparable in vivo cell culture systems exists which enables the description of the kinetically time course of cytokines as foundation of further investigations of cytokine interactions as well as the testing of potential drugs. These days especially glucocorticoids are still frequently used for treatment of equine diseases because of their anti-inflammatory and immunomodulatory, but with respect to cytokines unspecific properties.
Objectives of the investigations
The aim of the study was to develop an easy, quick, cheap and reproducible ex vivo method for measuring cytokines (tumor necrosis factor alpha [TNF-α], interleukin-1 receptor antagonist [IL-1Ra] and interferon gamma [IFN-γ]) and their time- and concentration-dependent release in the equine whole blood cell culture. Whereby the impact of the glucocorticoids dexamethasone (DEX) and hydrocortisone (HC) on production of TNF-α, IL-1Ra and IFN-γ should be investigated subsequently. Currently, cytokines, their release and eventuation of their mediated effects are objects of actual research with the aim to reveal specific interactions and thus be able to establish purposeful therapeutic agents. This could be beneficial especially for horses which display a susceptibility to septic diseases or equine asthma.
Material and Methods
Therefore horse whole blood diluted to 10%, 20% and 50% was stimulated with lipopolysaccharide (LPS), a combination of phytohemagglutinin, concanavalin A, pokeweed mitogen and LPS (PCPwL) or equine recombinant TNF-α (erTNF-α). To generate cytokine kinetics TNF-α, IL-1Ra and IFN-γ were analyzed in culture supernatants, which were collected at different time points using specific enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). In further investigations within the equine whole blood cell culture DEX and HC were applied with concentrations between 10-12 and 10-5 M to modulate LPS- or PCPwL-induced cytokine release. Statistics were performed by calculation of means with associated standard errors. Statistical significances were assessed by one- and two-way analysis of variance.
Results
The evaluations revealed that cytokines could be detected optimal in whole blood cell cultures with 20% blood volume. TNF-α, IL-1Ra and IFN-γ were released time-dependently and differing kinetics were displayed. PCPwL-induced TNF-α and IL-1Ra release was enhanced continuously over 24 - 48 hours, respectively. Similarly, LPS-stimulated TNF-α was at maximum at time points between 8 - 12 hours and started to decrease thereafter, whereas IL-1Ra peaked 24 hours later and rather continued to accumulate beyond 48 hours. ErTNF-α could induce also the IL-1Ra release. PCPwL- induced IFN-γ release started time displaced and showed a continuously enhanced course over 48 - 72 hours. In subsequent investigations within equine whole blood cell culture, LPS-induced TNF-α and IL-1Ra as well as PCPwL-induced IFN-γ production were more potently suppressed concentration-dependently by DEX than by HC. DEX inhibited cytokine release with the inhibition concentration (IC50) 0.09 μM (TNF-α), 0.453 μM (IL-1Ra) and 0.001 μM (IFN-γ), whereas HC with IC50 values of 1.45 μM (TNF-α), 2.96 μM (IL-1Ra) and 0.09 μM (IFN-γ).
Conclusion
In conclusion our results could suggest the eminent suitability of equine whole blood cell culture to assess the release of a variety of cytokines following successful mitogen stimulation. Therefore the model of the equine whole blood cell culture provides, because of its advantages including simple and cheap performance in an in vivo close physiological ambient, the opportunity to evaluate the cytokine status of healthy and diseased horses. Furthermore it could give the proof of its benefit and reliability to evaluate potential equine drugs and immunological coherences of the horse.:INHALTSVERZEICHNIS I
ABBILDUNGSVERZEICHNIS III
TABELLENVERZEICHNIS III
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV
1 EINLEITUNG 1
2 LITERATURÜBERSICHT 3
2.1 Allgemeine wissenschaftliche Hintergründe 3
2.1.1 Das Blut und das Immunsystem des Pferdes 3
2.1.1.1 Zusammensetzung des equinen Blutes 3
2.1.1.2 Allgemeiner Aufbau des Immunsystems 4
2.1.2 Zytokine und Entzündungsreaktionen - Mediation der Immunantwort durch Zytokine und Chemokine 14
2.1.2.1 Pro-inflammatorische Zytokine: Tumornekrosefaktor-α und Interferon-γ 17
2.1.2.2 Anti-inflammatorische Zytokine: Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist 19
2.2 Therapeutische Beeinflussung der Zytokin- und Mediator-Freisetzung 21
2.2.1 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch Glukokortikoide 21
2.2.2 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch weitere Pharmaka und Substanzen 23
2.2.2.1 NSAID 23
2.2.2.2 Small molecules und Anti-Zytokinantikörper 24
2.3 Equine Zellkulturmodelle zur Zytokindetektion 25
2.3.1 Stimulation der Zytokinfreisetzung 26
2.3.2 Vollblutzellkultursysteme und Systeme mit isolierten Zellen 27
2.4 Fragestellung der Dissertation 30
3 PUBLIKATIONEN 31
3.1 Freisetzungskinetik von TNF-α und IL-1Ra im equinen Vollblut 32
3.2 Modulation der Freisetzung von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur durch Glukokortikoide 40
4 DISKUSSION 45
4.1 Zytokinfreisetzung im equinen Vollblut 46
4.2 Der Einfluss von Glukokortikoiden auf die Zytokinfreisetzung 52
4.3 Schlussfolgerungen 56
4.4 Ausblick 56
5 ZUSAMMENFASSUNG 58
6 SUMMARY 60
7 LITERATURVERZEICHNIS 62
8 ANHANG 72
8.1 Freisetzungskinetik von IFN-γ 72
8.2 Konzentration von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur 72
9 DANKSAGUNG 74
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:36223 |
| Date | 21 November 2019 |
| Creators | Rütten, Simon |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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