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pereira_fdc_me_rcla.pdf: 1421119 bytes, checksum: 8743dede24fc8cac2d9cc226ac3e63d9 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Polybia paulista é uma vespa pertencente à ordem Hymenoptera muito comum no Sudeste do Brasil, especialmente no Estado de São Paulo. Os venenos destes insetos são constituídos por aminas, peptídeos, proteínas de alta massa molecular, sendo estas na sua maioria, enzimas. As fosfolipases são as enzimas de maior abundância entre os alérgenos de veneno dos Hymenoptera sociais, constituindo-se também no alérgeno de maior importância. A sequência completa de 985 pb do cDNA da fosfolipase A1 do veneno da vespa P. paulista foi determinada a partir da clonagem. A proteína deduzida por tradução apresentou 302 resíduos de aminoácidos, PI e MW teóricos de 9,1 e 33 kDa respectivamente. Por meio de ferramentas de bioinformática foi possível identificar o sítio ativo entre os resíduos 131 a 140 (10 aminoácidos) e inferir que se trata de uma proteína da super família das esterases lipases. O cDNA completo foi clonado em vetor de expressão pET-28a em cepas de Escherichia coli BL21–DE3. A PLA1-Rec com cauda de 6x Histidinas no N- terminal foi expressa na forma insolúvel em corpúsculos de inclusão por meio da indução com 1mM de IPTG à 20°C por 6 horas. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em resina agarose-Ni+2 sob condições desnaturantes na presença de 8 M de uréia e a proteína eluida com tampão gradiente decrescente de pH. As análises de Western blotting revelaram a especificidade dos anticorpos policlonais produzidos em camundongos contra a fração eletroforética de PLA1 natural quando testados com o veneno bruto da própria vespa e com a PLA1- Rec de P. paulista. Além disto, estes anticorpos apresentaram imunoreatividade cruzada com o veneno bruto de outras vespas sociais testadas neste trabalho. Outras proteínas detectadas na membrana de nitrocelulose evidenciaram o reconhecimento dos... / Polybia paulista is a wasp that belongs to the Hymenoptera order very common in southeastern Brazil, especially in São Paulo. The venoms of these insects are composed of amines, peptides, high weight molecular proteins, which are mainly enzymes. The phospholipase enzymes are the most abundant among the allergens of social Hymenoptera venom, and they are also the most important allergen. The complete sequence of 985 bp of phospholipase A1 cDNA from P. paulista venom was determined by cloning. The protein inferred by translation had 302 amino acid residues, PI and theoretical MW of 9.1 and 33 kDa respectively. By means of bioinformatics tools, it was possible to identify the active site between residues 131 to 140 (10 amino acids) and infer that it is a protein that belongs to esterases lipases super family. The complete cDNA was cloned into pET-28a expression vector in strains of BL21-DE3 Escherichia coli. The Rec-PLA1 with 6x histidine tail at the N-terminal was expressed in insoluble form in inclusion corpuscles by induction with 1mM IPTG at 20 ° C for 6 hours. The purification was performed by affinity chromatography on agarose-Ni+2 resin under denaturing conditions in the presence of 8 M urea and the protein eluted with decreasing pH gradient buffer. The Western blotting analyses revealed the specificity of polyclonal antibodies produced in mice against the electrophoretic fraction of natural PLA1 when tested with the crude venom of the wasp itself and with the PLA1- Rec of P. paulista. Besides these antibodies presented cross-immunoreactivity with the crude venom of other social wasps tested in this work. Other proteins detected in the nitrocellulose membrane showed the recognition of antibodies to other isoforms of phospholipase already described in the literature. Obtaining the recombinant form of... (Complete abstract click electronic access below)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unesp.br:11449/87705 |
| Date | 23 February 2012 |
| Creators | Pereira, Franco Dani Campos [UNESP] |
| Contributors | Universidade Estadual Paulista (UNESP), Braga, Márcia Regina Brochetto [UNESP] |
| Publisher | Universidade Estadual Paulista (UNESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | 93 f. : il. color., tabs. |
| Source | Aleph, reponame:Repositório Institucional da UNESP, instname:Universidade Estadual Paulista, instacron:UNESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | -1, -1 |
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