Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose visceral (LV) é um grave problema de saúde pública no Brasil. Na área
urbana o cão é a principal fonte de infecção e o controle da LV no Brasil envolve a
eliminação de cães infectados. Testes sorológicos são utilizados para os levantamentos
rotineiros, mas estes apresentam problemas de especificidade e sensibilidade. Os métodos
moleculares como a PCR são úteis tanto no diagnóstico como na identificação das espécies de
Leishmania. São capazes de detectar animais infectados soronegativos e são mais sensíveis e
específicos, particularmente no diagnóstico de cães assintomáticos. Um dos maiores
obstáculos na implementação de ensaios moleculares é a falta de padronização. Mais de 400
publicações sobre o diagnóstico molecular da leishmaniose foram realizadas desde 1989,
porém pouquíssimas compararam a eficiência das diversas técnicas disponíveis. O objetivo
deste trabalho foi comparar diferentes métodos de PCR em diferentes amostras clínicas para o
diagnóstico de leishmaniose visceral canina (LVC) em cães assintomáticos. Amostras clínicas
de medula óssea, sangue periférico, swab conjuntival e biópsias de pele foram analisadas
pelos métodos kDNA PCR hibridização, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR),
Leishmania nested PCR (LnPCR) e Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR).
Foram utilizados 30 cães assintomáticos positivos na sorologia e no exame parasitológico.
Seis cães não infectados foram utilizados como controles. A extração de DNA a partir dos
swabs foi realizada pelo método do Fenol-Clorofórmio. Para as amostras de sangue, medula e
biópsias de pele foram utilizados kits comerciais. As análises pelo método kDNA PCR
hibridização detectaram 5/30 (16,7%) cães positivos para as amostras de sangue periférico,
17/30 (57%) para pele, 19/30 (63,3%) para medula e 21/30 (70%) para swab conjuntival.
Utilizando-se o método kDNA snPCR, foram encontrados 7/30 (23,3%) cães positivos para
sangue periférico, 17/30 (57%) para pele, 12/30 (40%) para as amostras de medula e 24/30
(80%) para amostras de swab conjuntival. Através de método LnPCR foram detectados 9/30
(30%) cães positivos para as amostras de sangue periférico, 15/30 (50%) para medula, 13/30
(43,3%) para as amostras de pele e 19/30 (63,3%) para swab conjuntival. As análises pelo
método ITS-1 nPCR das amostras de sangue periférico detectaram 19/30 (63,3%) cães
positivos, 19/30 (63,33%) para pele, 29/30 (97%) para medula óssea e 29/30 (97%) para swab
conjuntival. Quando comparados os métodos com base no somatório das positividades obtidas
para todas as amostras clínicas, o método ITS-1 nPCR obteve 96/120 resultados positivos, o
kDNA PCR hibridização 62/120, o kDNA snPCR 60/120 e o LnPCR 56/120. Na
comparação da amostras com base na positividade obtida para todos os métodos o swab
conjuntival apresentou 93/120 resultados positivos, a medula 68/120, a pele 63/120 e o
sangue 40/120. Os resultados deste estudo indicam o swab conjuntival associado ao método
ITS 1 nPCR como a melhor opção, entre os métodos e amostras testados, para o diagnóstico
molecular da leishmaniose visceral canina em animais assintomáticos.
Palavras-chave:
Leishmaniose Visceral canina; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR); Diagnóstico. / Visceral Leishmaniasis (VL) is a serious public health problem in Brazil. In the urban area the
dog is the main source of infection and VL control in Brazil involves the elimination of
infected dogs. Serological tests are used for routine surveys, but they present problems of
specificity and sensitivity. Molecular methods as the PCR are useful in the diagnosis and
identification of Leishmania species. PCR is able to detect seronegative animals and is more
sensitive and specific, particularly in the diagnosis in asymptomatic dogs. One obstacle on the
implementation of molecular assays is the lack of standardization. More than 400 articles on
the diagnosis of leishmaniasis had been pubhished since 1989, however a few studies had
compared the efficiency of the diverse available techniques. The aim of this work was
compare different methods of PCR in different clinical samples for the diagnosis of canine
visceral leishmaniasis (CVL) in asymptomatic animals. Bone marrow, peripheral blood,
conjunctival swab and skin biopsies had been analyzed by the methods kDNA PCR -
Hybridization, kDNA semi nested PCR (kDNA snPCR), Leishmania nested PCR (LnPCR) e
Internal Transcribed Spacer 1 nested PCR (ITS-1 nPCR). Thirty positive asymptomatic dogs
for serology and parasitology examination had been used. Six not infected dogs had been used
as controls. The DNA extration from swabs was performed by Phenol-Chloroform method.
Commercial kits had been used for DNA extraction of peripheral blood, bone marrow and
skin biopsies. The kDNA PCR - Hybridization detected 5/30 (16.7%) positive dogs for
peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 19/30 (63.3%) for bone marrow and 21/30 (70%) for
conjunctival swab. Using the method kDNA snPCR had been found 7/30 (23.3%) positive
dogs for peripheral blood, 17/30 (57%) for skin, 12/30 (40%) for bone marrow and 24/30
(80%) samples of conjunctival swab. Through LnPCR method 9/30 (30%) positive dogs for
the samples of peripheral blood had been detected, 15/30 (50%) for bone marrow, 13/30
(43.3%) for the samples of skin and 19/30 (63.3%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR
analyse showed 19/30 (63.3%) positive dogs for peripheral blood, 19/30 (63.33%) for skin,
29/30 (97%) for bone marrow and 29/30 (97%) for conjunctival swab. The ITS-1 nPCR was
superior to other methods based on the positivities obtained using the summatory of all
clinical samples. The ITS-1 nPCR obtained 96/120 positive results, kDNA PCR-hibridization
62/120, kDNA snPCR 60/120 and LnPCR 56/120. The conjunctival swab presented the best
result considering the summatory of the positivities obtained by all methods. The conjunctival
swab obtained 93/120 positive results, medula 73/120, skin biopsies 68/120 and blood 40/120.
The results of this study indicated the conjunctival swab associated to ITS-1 nPCR as the best
option for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis in asymptomatic dogs, among the
methods and samples analysed.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:bdtd.cdtn.br:108 |
| Date | 23 February 2011 |
| Creators | Virgínia Mendes Carregal |
| Contributors | Antero Silva Ribeiro de Andrade, Maria José Neves, Maria Norma de Melo |
| Publisher | CNEN - Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, Belo Horizonte, CTRA - Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia das Radiações, Minerais e Materiais, CDTN, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações do CDTN, instname:Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear, instacron:CDTN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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