Die Nierentransplantation ermöglicht Patienten die Wiederherstellung der Nierenfunktion. Aufgrund der begrenzten Verfügbarkeit an Organen nimmt dabei die Zahl der Transplantationen von einem lebenden Spender stetig zu. Zudem ermöglichen die präzisen und genauen Vorbereitungen und Abläufe bei Lebendnierenspenden eine bessere 5-Jahres-Überlebensrate als bei Kadaverspenden. Die genetische Verschiedenheit zwischen Spender und Empfänger bedingt jedoch eine lebenslange immunsuppressive Therapie, um Abstoßungsreaktionen und damit das Scheitern einer Organtransplantation zu verhindern. An den Universitätskliniken Leipzig und Halle/Saale besteht diese Therapie aus einer Dreifachkombination von Tacrolimus, Mycophenolat-Mofetil
und Prednisolon, wobei mögliche Nebenwirkungen wie opportunistische Infektionen, kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen sowie Tumore in Kauf genommen werden. Zudem besteht für den immunsupprimmierten Organismus die ständige Gefahr einer Abstoßungsreaktion. Diese Aspekte führen bei den Empfängern zu einer massiven Einschränkung der Gesundheit und Lebensqualität.
Inwieweit die ausgeprägte Immunsuppression notwendig ist, bleibt unklar und muss
individuell festgelegt werden. Bisher existiert kein geeignetes Verfahren für ein
Immunmonitoring, weshalb in vielen Fällen eine umfangreiche und überdosierte
Immunsuppression in Kauf genommen wird.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein geeignetes Testverfahren, der Elispot-Assay, für die Expression der beiden proinflammatorischen Zytokine IFN-γ und IL-17 erstellt. Dafür wurden die PBMC der Spender und Empfänger aus Vollblut separiert, um sie
anschließend sowohl separat als auch in einer Lymphozytenmischreaktion zu untersuchen. Die Darstellung von IL-17 konnte nur aufgrund einer zusätzlichen Stimulation mit OKT3 gelingen, während der IFN-γ-Elispot sowohl im Leerwert als auch unter Stimulation mit IL-2 zu ausreichenden Spotanzahlen führte. Die Spotanzahlen der Spender-PBMC wurden mit Hilfe von γ-Strahlung signifikant reduziert (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001), um in den Lymphozytenmischreaktionen die alleinige Zytokinausschüttung der Empfänger-PBMC messen zu können. Die Spender- PBMC fungierten dabei nur als Antigene.
Insgesamt konnten zwischen 2009 und 2012 zwölf von siebzehn Patientenpaaren in die Studie eingeschlossen werden. Die Spotanzahlen der Paare wurden dabei sowohl im IFN-γ- als auch im IL-17-Elispot-Assay zu vier unterschiedlichen Zeitpunkten gemessen (vor Transplantation | 21±3 d postoperativ | 28±3 d postoperativ | 75±15 d postoperativ). In den meisten Fällen zeigte sich vor Transplantation eine erhöhte Spotanzahl im Vergleich zu den drei postoperativen Werten. Zudem stiegen die Spotanzahlen sowohl für IFN-γ als auch für IL-17 nach niedrigen Messergebnissen kurz nach der Transplantation im postoperativen Verlauf wieder an und erreichten in einigen Fällen die Spotanzahl der präoperativen Ausgangswerte. Ein signifikanter Unterschied konnte aufgrund der geringen
Fallzahl nicht erreicht werden. Die kurzfristige Reduktion der Spotanzahlen postoperativ ist dabei aller Wahrscheinlichkeit nach auf die hohen Dosen an immunsuppressiven Medikamenten zurückzuführen. Insgesamt zeigten die Verläufe der IFN-γ- und der IL-17- Elispot-Assays ähnliche Verläufe. Daraus lässt sich schlussfolgern, dass der IL-17-Elispot- Assay in Bezug auf mögliche Abstoßungsreaktionen eine ähnliche Aussagekraft besitzen könnte wie der bereits vielfach untersuchte IFN-γ-Elispot-Assay. Weiterhin wurden die Messergebnisse mit der Serumkreatininmolarität verglichen. Diese zeigte präoperativ höhere Molaritäten als postoperativ, wobei die postoperativen Molaritäten im Verlauf, im Gegensatz zu den Elispot-Messungen, abnahmen, was das Einsetzen der Nierenfunktion widerspiegelt. Unter den zwölf Patientenpaaren gab es keine einzige nachgewiesene akute Abstoßungsreaktion, der Verlauf der Serumkreatininmolaritäten war bei allen zwölf Empfängern vergleichbar. Demzufolge konnten die Werte der Elispot-Assays nicht herangezogen werden, um an ihnen eine Abstoßungsreaktion der transplantierten Nieren erkennen zu können. Das präoperative Abschätzen einer möglichen Abstoßungsreaktion anhand der Elispot-Assays konnte aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen ebenfalls
nicht untersucht werden.
Zusätzlich wurde bei den Patienten eine HLA-Typisierung vorgenommen, wobei der
Bereich von optimalen bis maximal ungünstigen Konstellationen reichten (HLA-Mismatch: 0-0-0 bis 2-2-2). Auch hier konnten die Ergebnisse nicht mit möglichen Abstoßungsreaktionen verglichen werden.
In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Varianten untersucht, die das Abschätzen einer Immunreaktion nach Nierentransplantation (Immunmonitoring) ermöglichen könnten. Aufgrund fehlender Abstoßungsreaktionen bei den Empfängern konnte das Testverfahren nicht an den klinischen Verläufen validiert werden. Mit dem in dieser Arbeit entwickelten Messverfahren kann jedoch eine neue und größer angelegte Studie erfolgen, die in Zukunft ein Immunmonitoring bei Patienten nach Nierentransplantation ermöglicht.:I Inhaltsverzeichnis................................................................I
II Bibliographische Beschreibung....................................................................IV
III Abkürzungsverzeichnis...................................................................................V
1 Einleitung...........................................................................................................01
1.1 Die T-Zell-vermittelte Immunität..................................................................01
1.1.1 Die verschiedenen Klassen der T-Lymphozyten................................ 01
1.1.2 Interferon-gamma als proinflammatorisches Zytokin......................... 04
1.1.3 Interleukin-17............................................................................................. 04
1.2 Die Nierentransplantation........................................................................... 05
1.2.1 Einführung.................................................................................................. 05
1.2.2 Besonderheiten der Lebendnierenspenden........................................ 06
1.3 Therapeutika bei Lebendnierenspenden................................................. 07
1.3.1 Calcineurininhibitoren............................................................................... 07
1.3.2 Prednisolon.................................................................................................. 08
1.3.3 Mycophenolat-Mofetil................................................................................. 09
1.4 Komplikationen bei Transplantationen....................................................... 10
1.4.1 Opportunistische Infektionen..................................................................... 10
1.4.2 Kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen................................ 11
1.4.3 Maligne Tumore.............................................................................................11
1.5 Transplantatrejektion........................................................................................ 12
1.5.1 Akute Abstoßungsreaktion............................................................................12
1.5.2 Chronische Transplantatnephropathie......................................................13
1.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................15
I2 Materialien und Methoden................................................................................. 16
2.1 Studiendesign.................................................................................................... 16
2.2 Materialien.......................................................................................................... 17
2.3 Methoden............................................................................................................ 19
2.3.1 Blutentnahmen................................................................................................ 19
2.3.2 Lymphozytenseparation.................................................................................19
2.3.3 Bestimmung der Zellzahl............................................................................... 20
2.3.4 Kryokonservierung der Zellen...................................................................... 20
2.3.5 Auftauen von kryokonservierten Zellen...................................................... 20
2.3.6 Bestrahlung von Zellen...................................................................................21
2.3.7 Stimulanzien.................................................................................................... 21
2.3.8 Durchflusszytometrie...................................................................................... 22
2.3.9 Elispot-Assay.................................................................................................... 23
3 Ergebnisse............................................................................................................... 29
3.1 Charakteristika der Patienten............................................................................ 29
3.2 Medikamentöse Therapieschemata nach Nierentransplantationen.......... 32
3.3 Versuche zur Etablierung des Elispot-Verfahrens......................................... 33
3.3.1 Vorversuche zum Nachweis von IFN-γ........................................................ 34
3.3.2 Vorversuche zum Nachweis von IL-17........................................................ 36
3.3.3 Versuche mit FKS-freiem Medium.................................................................37
3.3.4 Vitalitätsmessung in der Durchflusszytometrie.......................................... 38
3.4 Vergleich von Buffy Coats mit Patientenproben im Elispot-Assay..............38
3.5 Elispot-Assays der Spender-Empfänger-Paare............................................ 39
3.5.1 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IFN-γ........................40
3.5.2 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IL-17....................... 45
II3.6 Elispot-Ergebnisse unter Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität........49
4 Diskussion............................................................................................................... 50
4.1 Bewertung der Methoden.................................................................................. 51
4.1.1 Patientenauswahl und -akquirierung........................................................... 51
4.1.2 Durchflusszytometrie....................................................................................... 51
4.1.3 Elispot-Assay..................................................................................................... 52
4.2 Vitalitätsmessung................................................................................................. 53
4.3 Elispot-Ergebnisse............................................................................................... 53
4.3.1 Vergleich der unbestrahlten und bestrahlten Elispot-Assays................... 53
4.3.2 Elispot-Assays der Patienten.......................................................................... 54
4.3.2.1 IFN-γ-Elispot-Assay........................................................................................ 54
4.3.2.2 IL-17-Elispot-Assay.........................................................................................56
4.3.2.3 IFN-γ-Elispot-Assay und IL-17-Elispot-Assay im Vergleich.................... 57
4.4 HLA-Merkmale und Serumkreatininmolarität...................................................58
4.5 Schlussfolgerung und Ausblick...........................................................................59
5 Zusammenfassung...................................................................................................62
6 Abstract...................................................................................................................... 65
7 Literaturverzeichnis................................................................................................. 67
8 Tabellenverzeichnis.................................................................................................83
9 Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 84
10 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit............................. 85
11 Lebenslauf..............................................................................................................86
12 Danksagung.......................................................................................................... 87 / Introduction
Since the first kidney transplantation in the 1950ies, kidney transplantation is still being challenged by graft dysfunction and complete graft failure. Permanent immunsuppressive treatment is mandatory to avoid an unfavourable outcome. The treatment with Prednisolone, Tacrolimus and Mycophenolat-Mofetil may cause toxic side effects resulting in Diabetes mellitus, hypertension, infections and cancer.
In the present study we tried to demonstrate that the amount of spots in the Enzyme linked immunospot assay (Elispot-Assay) of IFN-γ and IL-17 correlates with the probability of graft dysfuction and complete graft failure. We also compared the results to clinical parameters.
Methods
Between the years 2009 and 2012, twelve pairs of related living kidney transplantations were included in this study. From each pair blood samples were taken at four time points (before transplantation, and at 21±3, 28±3 and 75±15 days after kidney transplantation, respectively). After establishing the technique of IFN-γ- and IL-17-Elispot-Assays, we separated the periphale blood mononuclear cells (PBMC) and performed follow up examinations at the four time points mentioned above. The PBMC of each donor and each recipient were examined separatly, and in addition together in a lymphocyte mixed reaction. We stimulated the PBMC of the IFN-γ-Elispot with Interleukin-2 (IL-2) and the PBMC of the IL-17-Elispot with OKT3 to get significant characteristics. PBMC of the donors were irradiated with 30 Gy before mixing them with the PBMC of the recipients. We also took the HLA-matches and serum creatinine molarity to compare important clinical parameters with the results of the Elispot-Assays.
Results
Sufficient spots were measured using the unstimulated and stimulated IFN-γ-Elispot and the stimulated IL-17-Elispot. Radiation was significant at all three tests (IFN-γ: p=0,047 | IFN-γ + IL-2: p=0,007 | IL-17: p = 0,001). All twelve recipients showed a high number of spots before transplantation in both types of Elispot-Assays and most of them an increasing number of spots after a minimal turning point three weeks after transplantation. Due to the small number of cases, no significant results could be obtained at follow up.
Non recipient developed a graft rejection as proven by biopsy or graft failure. The molarity of serum creatinine was permanently reduced whereas it was high before transplantation. Because of the abscence of any rejection episodes, HLA matches could not be compared.
Discussion
Due to the absence of rejection episodes or graft failure, no prediction for rejection by the IFN-γ- and IL-17-Elispot was possible. The low number of cases of living related kidney transplantation demonstrated the challange of the investigation of living related kidney transplantation. Although we could prove a significant effect of the irradiation of PBMC, there was no significant result in the follow up investigations. A higher number of cases are needed in future investigations. The established method of the IFN-γ- and IL-17-Elispot can be used in a future study with an extended number of cases and a longer follow up of time.:I Inhaltsverzeichnis................................................................I
II Bibliographische Beschreibung....................................................................IV
III Abkürzungsverzeichnis...................................................................................V
1 Einleitung...........................................................................................................01
1.1 Die T-Zell-vermittelte Immunität..................................................................01
1.1.1 Die verschiedenen Klassen der T-Lymphozyten................................ 01
1.1.2 Interferon-gamma als proinflammatorisches Zytokin......................... 04
1.1.3 Interleukin-17............................................................................................. 04
1.2 Die Nierentransplantation........................................................................... 05
1.2.1 Einführung.................................................................................................. 05
1.2.2 Besonderheiten der Lebendnierenspenden........................................ 06
1.3 Therapeutika bei Lebendnierenspenden................................................. 07
1.3.1 Calcineurininhibitoren............................................................................... 07
1.3.2 Prednisolon.................................................................................................. 08
1.3.3 Mycophenolat-Mofetil................................................................................. 09
1.4 Komplikationen bei Transplantationen....................................................... 10
1.4.1 Opportunistische Infektionen..................................................................... 10
1.4.2 Kardiovaskuläre und metabolische Erkrankungen................................ 11
1.4.3 Maligne Tumore.............................................................................................11
1.5 Transplantatrejektion........................................................................................ 12
1.5.1 Akute Abstoßungsreaktion............................................................................12
1.5.2 Chronische Transplantatnephropathie......................................................13
1.6 Zielsetzung der Arbeit.......................................................................................15
I2 Materialien und Methoden................................................................................. 16
2.1 Studiendesign.................................................................................................... 16
2.2 Materialien.......................................................................................................... 17
2.3 Methoden............................................................................................................ 19
2.3.1 Blutentnahmen................................................................................................ 19
2.3.2 Lymphozytenseparation.................................................................................19
2.3.3 Bestimmung der Zellzahl............................................................................... 20
2.3.4 Kryokonservierung der Zellen...................................................................... 20
2.3.5 Auftauen von kryokonservierten Zellen...................................................... 20
2.3.6 Bestrahlung von Zellen...................................................................................21
2.3.7 Stimulanzien.................................................................................................... 21
2.3.8 Durchflusszytometrie...................................................................................... 22
2.3.9 Elispot-Assay.................................................................................................... 23
3 Ergebnisse............................................................................................................... 29
3.1 Charakteristika der Patienten............................................................................ 29
3.2 Medikamentöse Therapieschemata nach Nierentransplantationen.......... 32
3.3 Versuche zur Etablierung des Elispot-Verfahrens......................................... 33
3.3.1 Vorversuche zum Nachweis von IFN-γ........................................................ 34
3.3.2 Vorversuche zum Nachweis von IL-17........................................................ 36
3.3.3 Versuche mit FKS-freiem Medium.................................................................37
3.3.4 Vitalitätsmessung in der Durchflusszytometrie.......................................... 38
3.4 Vergleich von Buffy Coats mit Patientenproben im Elispot-Assay..............38
3.5 Elispot-Assays der Spender-Empfänger-Paare............................................ 39
3.5.1 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IFN-γ........................40
3.5.2 Ergebnisse der Elispot-Assays zum Nachweis von IL-17....................... 45
II3.6 Elispot-Ergebnisse unter Berücksichtigung der HLA-Kompatibilität........49
4 Diskussion............................................................................................................... 50
4.1 Bewertung der Methoden.................................................................................. 51
4.1.1 Patientenauswahl und -akquirierung........................................................... 51
4.1.2 Durchflusszytometrie....................................................................................... 51
4.1.3 Elispot-Assay..................................................................................................... 52
4.2 Vitalitätsmessung................................................................................................. 53
4.3 Elispot-Ergebnisse............................................................................................... 53
4.3.1 Vergleich der unbestrahlten und bestrahlten Elispot-Assays................... 53
4.3.2 Elispot-Assays der Patienten.......................................................................... 54
4.3.2.1 IFN-γ-Elispot-Assay........................................................................................ 54
4.3.2.2 IL-17-Elispot-Assay.........................................................................................56
4.3.2.3 IFN-γ-Elispot-Assay und IL-17-Elispot-Assay im Vergleich.................... 57
4.4 HLA-Merkmale und Serumkreatininmolarität...................................................58
4.5 Schlussfolgerung und Ausblick...........................................................................59
5 Zusammenfassung...................................................................................................62
6 Abstract...................................................................................................................... 65
7 Literaturverzeichnis................................................................................................. 67
8 Tabellenverzeichnis.................................................................................................83
9 Abbildungsverzeichnis........................................................................................... 84
10 Erklärung über die eigenständige Verfassung der Arbeit............................. 85
11 Lebenslauf..............................................................................................................86
12 Danksagung.......................................................................................................... 87
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:13602 |
| Date | 21 September 2015 |
| Creators | Grehn, Conrad |
| Contributors | Sack, Ulrich, Wagner, Ulf, Rasche, Franz M., Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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