[ES] El objetivo de la presente tesis doctoral es el estudio, desarrollo y validación de diferentes métodos inmunoquímicos que permitan determinar contaminantes químicos en alimentos de origen vegetal y en agua, de manera que contribuyan a mejorar su calidad y por ende la seguridad del consumidor.
Spirotetramat es un plaguicida de nueva generación altamente eficiente, comercializado mundialmente para su uso como insecticida en multitud de cultivos agrícolas. Tiene propiedades sistémicas, ya que después de la absorción se transloca tanto a través del xilema como del floema, gracias a que es transformado por la planta en spirotetramat-enol, mucho más polar. En consecuencia, la definición de residuo de este insecticida en alimentos de origen vegetal para fines analíticos incluye también dicho metabolito. Por otro lado, anatoxina-a es un alcaloide secundario con neurotoxicidad aguda que se pueden encontrar en agua dulce. Esta toxina es producida por siete géneros diferentes de cianobacterias, y se ha detectado en lagos y otras fuentes de agua de todos los continentes.
El análisis de sustancias como spirotetramat y anatoxina-a se lleva a cabo actualmente mediante métodos cromatográficos como HPLC-MS. Estas técnicas presentan una elevada sensibilidad y fiabilidad; sin embargo, requieren personal altamente cualificado y un equipamiento caro y no portable. Una opción complementaria son los métodos inmunoquímicos, como el ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o el inmunoensayo de flujo lateral (LFIA, Lateral Flow ImmunoAssay), ya que son métodos de análisis rápidos y económicos, y además son muy versátiles permitiendo adaptarlos a necesidades analíticas particulares, como los ensayos de cribado de numerosas muestras o los ensayos portátiles con lectura visual de los resultados.
A partir de una colección de bioconjugados y de anticuerpos de spirotetramat y de anatoxina-a se caracterizó la afinidad y especificidad de los inmunorreactivos con el fin de seleccionar parejas conjugado/anticuerpo aptas para el desarrollo de inmunoensayos tipo ELISA y LFIA competitivos. Se optimizaron las condiciones de ensayo, y se llevó a cabo un estudio de la influencia de diferentes factores fisicoquímicos sobre los parámetros analíticos de los ensayos seleccionados. Posteriormente se evaluó la influencia de la matriz alimentaria, particularmente uva, zumo de uva y vino, así como de aguas de diferente procedencia, sobre la señal y la sensibilidad de los inmunoensayos.
La diferente afinidad de los anticuerpos hacia spirotetramat y spirotetramat-enol nos llevó a optimizar el tratamiento de muestra, incluyendo una etapa de hidrólisis para transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera controlada, rápida y cuantitativa. De este modo se hizo posible aportar resultados en forma de suma de la concentración de ambos compuestos en la muestra, tal y como exige la legislación vigente. Además, para la extracción de residuos de este insecticida a partir de muestras de uva se puso a punto un procedimiento empleando la tecnología QuEChERS, y para la reducción de interferencias de vinos y zumos se utilizó polivinilpolipirrolidona. En el caso de las aguas, se aplicó una simple filtración para eliminar partículas en suspensión.
Los inmunoensayos enzimáticos en microplaca optimizados para determinar de manera competitiva residuos de spirotetramat presentaron valores de IC50 para spirotetramat-enol en torno a 0.1 ng/mL, y límites de detección alrededor de 0.02 ng/mL. El estudio de la precisión y exactitud del método empleando muestras de alimentos dopados reflejó límites de cuantificación de 2.5 ng/mL para uva, zumos de uva y vinos, tanto blancos como tintos, muy por debajo de los límites máximos de residuos autorizados en la Unión Europea para este insecticida en dichos alimentos. / [EN] The aim of this doctoral thesis is the study, development and validation of different immunochemical methods for determining chemical contaminants in produce and water, in a way that they may contribute to improving food quality and therefore to assure consumer safety.
Spirotetramat is a highly efficient new-generation pesticide, marketed worldwide for use as insecticide in many agricultural crops. It has systemic properties, since short after absorption it translocates through both the xylem and the phloem, thanks to the fact that it is transformed by the plant into the much more polar spirotetramat-enol. Consequently, the residue definition for this insecticide in foods of plant origin with analytical purposes also includes said metabolite. On the other hand, anatoxin-a is a secondary alkaloid with acute neurotoxicity that can be found in fresh water. This toxin is produced by seven different genera of cyanobacteria, and has been detected in lakes and other water resources on all continents.
The analysis of substances like spirotetramat and anatoxin-a is currently carried out by chromatographic methods like HPLC-MS. These techniques are highly sensitive and reliable; however, they require highly qualified personnel and expensive, non-portable equipment. Nowadays, the immunochemical methods, such as the ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) or the LFIA (Lateral Flow ImmunoAssay), constitute excellent complementary analytical options to instrumental strategies, since they are fast and inexpensive analytical methods, and are also very versatile so they can be adapted to particular analytical needs, such as screening assays for large numbers of samples or portable tests with visual reading of the results.
The antibody affinity and specificity from a collection of spirotetramat and anatoxin-a immunoreagents was characterized in order to select conjugate/antibody pairs suitable for the development of competitive ELISA and LFIA tests. The assay conditions were optimized, and a study of the influence of different physicochemical factors over the analytical parameters of the selected immunoassays was carried out. Subsequently, the influence of the food matrix, particularly grape, grape juice and wine, as well as water from different sources, over the assay signal and sensitivity was evaluated.
The different affinity of the available antibodies towards spirotetramat and spirotetramat-enol led us to optimize the sample treatment procedure, so a hydrolysis step to transform spirotetramat into spirotetramat-enol in a controlled, rapid and quantitative way, was included. Thus, it was possible to provide results in the form of the sum of the concentration of both compounds in the sample, as required by current legislation. In addition, a procedure using QuEChERS technology was developed to extract residues of this insecticide from grape samples, and polyvinylpolypyrrolidone was used to reduce interferences from wines and juices. In the case of waters, a simple filtration was applied to remove suspended particles.
Microplate enzyme immunoassays that were optimized to competitively determine spirotetramat residues showed IC50 values for spirotetramat-enol around 0.1 ng/mL, and limits of detection around 0.02 ng/mL. Precision and accuracy studies with these immunoassays using fortified food samples reflected limits of quantification of 2.5 ng/mL for grapes, grape juices and wines, both white and red, well below the maximum residue limits authorized by the European Union for this insecticide in such foodstuffs. Finally, a comparative study with HPLC-MS/MS validated the studied immunoassay for analyzing spirotetramat residues in grape samples within a wide range of concentrations. / [CA] L’objectiu de la present tesi doctoral és l’estudi, desenvolupament i validació de diferents
mètodes immunoquímics que permeten determinar contaminants químics en aliments
d’origen vegetal i en aigua, de manera que contribuïsquen a millorar la seua qualitat i per tant
la seguretat dels consumidors.
Spirotetramat és un plaguicida de nova generació altament eficient, comercialitzat
mundialment per a l’ús com insecticida en multitud de cultius agrícoles. Té propietats
sistèmiques, ja que en ser absorbit es transloca tant a través del xilema com del floema,
gràcies a que és transformat per la planta en spirotetramat-enol, molt més polar.
Conseqüentment, la definició de residu d’aquest insecticida en aliments d’origen vegetal amb
finalitats analítiques inclou també l’esmentat metabòlit. D’una altra banda, anatoxina-a és un
alcaloide secundari amb neurotoxicitat aguda que es pot trobar en aigua dolça. Aquesta toxina
és produïda per set gèneres de cianobacteris diferents, i s’ha detectat en llacs i altres fonts
d’aigua de tots els continents.
L’anàlisi de substàncies com spirotetramat i anatoxina-a es duu a terme actualment
mitjançant mètodes cromatogràfics, com HPLC-MS. Aquestes tècniques presenten una elevada
sensibilitat i fiabilitat; tanmateix, requereixen personal altament qualificat i un equipament car
i no portable. Una opció complementària són els mètodes immunoquímics, com l’ELISA
(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) o l’immunoassaig de flux lateral (LFIA, Lateral Flow
Immunoassay), ja que són mètodes d’anàlisi ràpids i econòmics, i a més són molt versàtils, la
qual cosa permet adaptar-los a necessitats analítiques particulars, com són els assaigs per
destriar nombroses mostres o els assaigs portàtils amb lectura visual dels resultats.
A partir d’una col·lecció de bioconjugats i d’anticossos de spirotetramat i d’anatoxina-a es
va caracteritzar l’afinitat i especificitat dels immunorreactius amb la finalitat de seleccionar
parelles conjugat/anticòs aptes per desenvolupar immunoassaigs tipus ELISA i LFIA
competitius. S’optimitzaren les condicions d’assaig, i es va dur a terme un estudi de la
influència de diferents factors fisicoquímics sobre els paràmetres analítics dels assaigs
seleccionats. Posteriorment, es va avaluar la influència de la matriu alimentària,
particularment raïm, suc de raïm i vi, així com d’aigües de diferent procedència, sobre el senyal
i la sensibilitat dels assaigs.
La diferent afinitat dels anticossos cap a spirotetramat i spirotetramat-enol ens va dur a
optimitzar el tractament de mostra mitjançant la inclusió d’una etapa d’hidròlisi per transformar spirotetramat en spirotetramat-enol de manera ràpida, controlada i quantitativa.
D’aquesta manera es va fer possible aportar resultats en forma de suma de la concentració
d’ambdós composts en la mostra, tal i com exigeix la legislació vigent. A més a més, per
extraure residus d’aquest insecticida a partir de mostres de raïm es va posar a punt un
procediment emprant la tecnologia QuEChERS, i per reduir interferències de vins i sucs es va
utilitzar polivinilpolipirrolidona. En el cas de les aigües, es va aplicar una simple filtració per
eliminar partícules en suspensió.
Els immunoassaigs enzimàtics en microplaca optimitzats per determinar de manera
competitiva residus de spirotetramat presentaren valors d’IC50 per spirotetramat-enol al
voltant de 0.1 ng/mL, i límits de detecció propers a 0.02 ng/mL. L’estudi de la precisió i
exactitud del mètode emprant mostres d’aliments dopats va reflectir límits de quantificació de
2.5 ng/mL per raïm, sucs de raïm i vins, tant blancs com negres, molt per sota dels límits
màxims de residus autoritzats per la Unió Europea per a aquest insecticida en els esmentats
aliments. Finalment, un estudi comparatiu amb HPLC-MS/MS va validar l’immunoassaig
estudiat per analitzar residus de spirotetramat en mostres de raïm en un ampli rang de
concentracions. En el cas d’anatoxina-a, es van optimitzar dos immunoassaigs tipus ELISA
competitiu, els valors d’IC50 dels quals van estar entre 0.5 i 1.0 ng/mL, amb límits de detecció
per davall de 0.1 ng/mL. L’anàlisi de diferents tipus d’aigües fortificades amb anatoxina-a ens
va revelar que els immunoassaigs desenvolupats permeten quantificar aquesta cianotoxina
entre 0.5 i 500 ng/mL.
Addicionalment es van optimitzar i caracteritzar assaigs immunocromatogràfics, tipus
tires reactives, tant per spirotetramat com per anatoxina-a, vàlids com a tècniques portables i
ràpides per determinar semi-quantitativament aquestes substàncies tòxiques en vi i aigües,
respectivament. Seguint la normativa europea per a mètodes ràpids front a petites molècules
orgàniques, es va determinar el senyal indicatiu del llindar per distingir les mostres positives,
que superen la concentració de destriament establerta, de les negatives. En el cas de
spirotetramat, el mètode desenvolupat permet el triatge, tant instrumental com visual, amb
un interval de confiança del 99%, de mostres de vi amb una concentració de residu de 1000
ng/mL, equivalent al límit màxim de residus, expressada como la suma de spirotetramat més
spirotetramat-enol. Per anatoxina-a, les tires immunocromatográfiques desenvolupades van
poder detectar mostres d’aigua amb 2 ng/mL de l’esmentada cianotoxina amb una fiabilitat
del 99%, i mostres amb 1 ng/mL amb una probabilitat del 40%, mentre que el límit de detecció
visual va ser de 3 ng/mL. / A la Secretaría Nacional de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación
(SENESCYT), del gobierno de la República de Ecuador que al adjudicarme la beca bajo el
“PROGRAMA DE BECAS PARA DOCTORADO (PHD) PARA DOCENTES DE UNIVERSIDADES Y DE
ESCUELAS POLITÉCNICAS 2015”, permitió formarme como persona y profesional en mis
estudios de doctorado. / Cevallos Cedeño, RE. (2020). Desarrollo de métodos inmunoquímicos para la determinación de sustancias tóxicas en alimentos y aguas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/149570
| Identifer | oai:union.ndltd.org:upv.es/oai:riunet.upv.es:10251/149570 |
| Date | 02 September 2020 |
| Creators | Cevallos Cedeño, Ramón Eudoro |
| Contributors | Mercader Badia, Josep Vicent, Universitat Politècnica de València. Instituto Universitario de Ingeniería de Alimentos para el Desarrollo - Institut Universitari d'Enginyeria d'Aliments per al Desenvolupament, Secretaría de Educación Superior, Ciencia, Tecnología e Innovación, Ecuador |
| Publisher | Universitat Politècnica de València |
| Source Sets | Universitat Politècnica de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/acceptedVersion |
| Rights | http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/, info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.004 seconds