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Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Apesar de tratáveis e curáveis, o diagnóstico das infecções ativa (aTB) ou latente (LTBI) por M. tuberculosis permanece desafiador, impactando diretamente o controle da tuberculose. Portanto, a apresentação de indicativos clínico-epidemiológicos é de grande importância na detecção da aTB na rotina clínica. Os LTBI são assintomáticos, sendo majoritariamente diagnosticados pela resposta imune a antígenos (Ags) micobacterianos, seja pelo teste cutâneo à tuberculina (TCT), ou pelos ensaios de liberação de interferon-gama (IGRA) baseados nos Ags da região de diferença 1 (RD1) ESAT6:CFP10. Contudo, a pequena diminuição nas taxas de novos casos de TB sugere que estes testes devem ser aprimorados. Assim, propomos, i) a avaliação de novos marcadores antigênicos, via IGRA de curta (WBA) e longa (LSA) estimulação, utilizando combinação de Ags constituintes da parede celular (ESAT6:CF10 e PstS1/CFP10), Ags associados a fase de latência (LAA) (Rv2029c, Rv2031c, Rv2034, Rv2628 e Rv3353c), bem como a nova proteína fusionada PStS1(285- 374):CFP10; ii) a investigação de biomarcadores transcriptômicos ex vivo, via amplificação de genes-alvo (qRT-PCR multiplex) ou de sequenciamento de RNA (RNAseq). Para isto, foram coletadas amostras de sangue periférico provenientes de uma coorte prospectiva de contatos recentes (rCt) e pacientes com a TB pulmonar
O antígeno PstS-1(285-374):CFP10 apresentou-se mais seletivo que o tradicional ESAT6:CFP10 para os rCt com TCTpositivo (WBA = 42,9% vs 30,2%; LSA = 44,4% vs 41,3%). Em estudos longitudinais, a nova quimera foi capaz de detectar todos os casos incidentes em ambos os ensaios utilizados e de apresentar maior taxa de regressão pósquimioprofilaxia (WBA = 62,5% vs 37,5%; LSA = 77,8% vs 50%). Nenhum participante apresentou resposta exclusivamente aos Ags íntegros PstS1/CFP10. Dos LAA ensaiados, a combinatória dos Ags Rv2029c, Rv2031c e Rv2034 se destacou na detecção de respondedores ao IGRA-RD1 (93.5%). Frequência baixa de respondedores nos grupos controle (5,9%) e aTB (28,6%) foi observada para os LAA isoladamente, com aumento de detecção na combinatória (11,8% e 71,4%, respectivamente). Via amplificação multiplex de 170 alvos gênicos, os genes IFI35, PLAUR, IFIT2, LRG1, DOK2, IFITM1 e KIF22 apresentaram modulação diferencial na aTB, mas, baixo potencial de discriminação entre os rCt (Controles ou LTBI. No grupo rCt-LTBI não houve modulação diferencial para estes genes. Via RNAseq, 56 ou 98 transcritos foram identificados estarem diferencialmente expressos na infecção latente ou ativa, respectivamente, mas mantendo-se especificidade >89%, apenas o gene KRT1 ofereceu sensibilidade de 81,3% na detecção de LTBI. Altamente promissor foi a expressão diferencial dos genes DOCK9, EPHA4 e NPC2, conferindo excelente sensibilidade para pacientes com aTB (100%), ou para indivíduos sadios com alto risco de progressão para aTB. Os potenciais marcadores/biomarcadores, com perfis de resposta celular ou por transcrição gênica gerados neste estudo, fornecem possibilidades de desenvolvimento de ferramentas diagnósticas para LTBI e a TB pulmonar / Despite treatable and curable, the diagnosis methods for active (aTB) or latent (LTBI)
M. tuberculosis infection remains challenging, directly affecting tuberculosis control. At
clinical routine, the detection of aTB commonly relies on the presentation of clinicalepidemiological
indicatives. The LTBI subjects are asymptomatic, being principally diagnosed
by the elicited immune response to mycobacterial antigens (Ags), either by tuberculin skin test
(TST) or, by interferon-gamma release assays (IGRA) using as stimuli Ags ESAT6 and
CFP10, both present in the region of difference 1 (RD1). However, the small decrease in
worldwide aTB incident cases suggests that nowadays tests for LTBI detection lack in
accuracy and should be improved.
Therefore, we propose the: i) evaluation of new antigenic markers, via IGRA short-
(WBA) and long- term (LSA) stimulation using combination of mycobacterial cell wall
antigens (ESAT6: CF10 and PstS1 / CFP10), latency-associated Ags (LAA: Rv2029c,
Rv2031c, Rv2034, Rv2628 and Rv3353c) and the new fused-protein PStS1(285-374):CFP10; ii)
investigation of ex vivo transcriptomic biomarkers, via target genes amplification (qRT-PCR
multiplex) or RNA sequencing (RNAseq). Therefore, peripheral blood samples were collected
from a prospective cohort of recent close contacts (rCt) and patients with pulmonary aTB.
Stimulation with the Ag PstS-1(285-374):CFP10 was more selective than the traditional
ESAT6:CFP10 at rCt-TCTpositive detection (WBA = 42.9% vs 30.2%; LSA = 44.4% vs 41,
3%). In longitudinal analysis, the new chimera was able to detect all incident cases by both
tests and showed higher post-chemoprophylaxis regression rates than the RD1 Ags (WBA =
62.5% vs 37.5%; 77.8% vs LSA = 50%). No participant showed exclusive response to
PstS1/CFP10 Ags. By combining the LAA Ags Rv2029c, Rv2031c and Rv2034, 93.5% of
rCt-IGRA-RD1 responders were detected. While, the frequency of LAA-responders was low
at control (5.9%) and aTB (28.6%) groups for the single LAA, or via Ags combination 11,8%
e 71,4% , respectively. Via multiplex amplification of 170 target- genes the IFI35, PLAUR,
IFIT2, LRG1, DOK2, IFITM1 and KIF22 demonstrated differential modulation at aTB, but
low accuracy, showing areas under the curve ( AUC) between 0.67 and 0.73. However, no
significant differential modulation was observed at LTBI group. Via RNAseq, 56 or 98
transcripts were found to be differentially expressed at latent or active infection, respectively.
Keeping specificity >89%, only KRT1 gene distinguished the LTBI from aTB
(sensitivity=81.3%), however, the DOCK9, EPHA4 and NPC2 genes were differentially
expressed, providing excellent sensitivity for aTB (100%), or health subjects with a higher
risk of progression (LTBI aTB). The potential of new markers/biomarkers, via cellular
response or gene transcription profile this study provide tools for the further development of
new LTBI and pulmonary aTB diagnostic tests. / 2100-04-25
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/14221 |
| Date | January 2015 |
| Creators | Araujo, Leonardo Silva de |
| Contributors | Moraes, Milton Ozório, Kritski, Afrânio Lineu, Almeida, Maria da Glória Bonecini, Melo, Fernanda C. Queiroz, Horn, Cynthia Silveira, Saad, Maria Helena Feres |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Restricted Acess, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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