Die Prävalenz von Adipositas, definiert durch einen BMI >30 kg/m2, und assoziierter Erkrankungen wie Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM), kardiovaskulärer Erkrankungen, und einiger Krebsentitäten nimmt weltweit dramatisch zu und bedingt das erhöhte Mortalitätsrisiko dieser Patientengruppe (Kopelman 2000; Stevens et al. 2012). Daneben lässt sich oft eine Adipositas-assoziierte, geringgrade, chronische Entzündung beobachten, die in den letzten Jahren als entscheidender Faktor in der Pathogenese dieser Komorbiditäten erkannt wurde (Spranger et al. 2003). Als Reaktion auf metabolische Veränderungen im viszeralen Fettgewebe (VAT) wird das Immunsystem aktiviert und Immunzellen mobilisiert (Strissel et al. 2007; O’Rourke et al. 2011). Besonders die Zahl der Fettgewebsmakrophagen (ATM) nimmt durch lokale Proliferation und vermehrte Einwanderung von Monozyten um ein Vielfaches zu, bis sie die dominante Immunzellpopulation im VAT darstellen (Weisberg et al. 2003). Sie sind durch einen proinflammatorischen M1-Phänotyp gekennzeichnet und sezernieren Zytokine wie Il-1β und IL-18, die nach Ausschwemmung in den peripheren Blutkreislauf eine systemische Immunantwort auslösen und die Sensitivität der Gewebe für Insulin über molekulare Wechselwirkungen erheblich abschwächen (Rui et al. 2002; Castoldi et al. 2016). Die daraus entstehende Insulinresistenz und schließlich T2DM wird deshalb nunmehr als Folge einer entzündlichen Fettgewebsdysfunktion verstanden, in deren Pathogenese die aktivierten ATM eine Schlüsselrolle einnehmen (Donath und Shoelson 2011). Die Produktion von IL-1β und IL-18 wird über einen zytosolischen Proteinkomplex, das Inflammasom, reguliert. Die Aktivierung dessen erfolgt nach initialer Sensitivierung durch Bindung eines Botenstoffs an den Rezeptor NLR family pyrin domain containing 3 (NLRP3) (Groslambert und Py 2018). Zu den diversen Faktoren, die NLRP3 aktivieren, gehört die G-Protein-vermittelte Aktivierung durch extrazelluläres Kalzium (exCa2+) bei Bindung an den Calcium-sensing Rezeptor (CaSR) (Lee et al. 2012; Rossol et al. 2012). In einem Zellmodell mit humanen, aus peripheren Monozyten differenzierten Makrophagen (MDM) konnte nach Stimulation der Zellen mit exCa2+ eine dosisabhängige Steigerung der IL-1β-Produktion verzeichnet werden (Thrum et al. 2019, Manuskript eingereicht).
Der erste Teil dieser Arbeit widmete sich deshalb der Frage, ob MDM bei Adipositas stärker als im schlanken Zustand auf exCa2+ reagieren und dieses Ion in der Folge als Faktor diskutiert werden müsste, der maßgeblich zur Entzündung im VAT beiträgt. Im Rahmen einer klinischen Studie wurden 31 adipöse und 23 nichtadipöse Probanden rekrutiert, die sich einer klinischen Untersuchung und Blutentnahme unterzogen. Als Zellmodell dienten MDM, die über sieben Tage in Medium mit 10 % autologem humanem Serum gereift waren, um eine phänotypische Differenzierung wie im Milieu des VAT zu gewährleisten. Nach einem Priming mit Lipopolysaccharid (LPS) wurden die Zellen mit exCa2 stimuliert und anschließend die IL-1β-Konzentration im Überstand mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) ermittelt. Tatsächlich ließ sich eine deutlich höhere Zytokinexpression in der adipösen Kohorte nachweisen. Von diesen Probanden wiesen 20 erhöhte Werte des Entzündungsmarkers C-reaktives Protein (CRP) im Blut auf (> 5 mg/l), was nach Ausschluss anderer Ursachen als Zeichen einer geringgradigen, Adipositas-induzierten Entzündung gewertet wurde. Elf der adipösen Probanden zeigten CRP-Werte < 5 mg/l. Eine im Vergleich zur Kontrollgruppe deutlich erhöhte IL-1β-Konzentration auch in dieser Gruppe ließ darauf schließen, dass die gesteigerte entzündliche Aktivität der MDM einer klinisch messbaren systemischen Aktivierung des Immunsystems vorausgeht und somit wahrscheinlich nicht Folge, sondern Mitverursacher der Adipositas-assoziierten Entzündung ist. Die sensitivere Reaktion der MDM in der adipösen Kohorte kann unterschiedlich interpretiert werden. Zum einen ist es möglich, dass eine bei Adipositas erhöhte Expression der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms die zelluläre Antwort auf aktivierende Reize wie exCa2+ verstärkt (Stienstra et al. 2010; Vandanmagsar et al. 2011). Zum anderen könnte ein höherer CaSR-Besatz an der Oberfläche der MDM bei Adipositas speziell das exCa2+ zum Gefahrensignal rangieren lassen (Malecki et al. 2013). Dafür spricht, dass sich die Werte des ionisierten Kalziums im Plasma zwischen den beiden Gruppen nicht signifikant unterschieden, sich jedoch ausschließlich in der adipösen Kohorte eine positive Korrelation zwischen ionisiertem Plasma-Kalzium und IL-1β-Sekretion nach Stimulation mit exCa2+ abzeichnete. In einem nächsten Schritt wäre es nötig, die Expression des CaSR und der Bestandteile des NLRP3-Inflammasoms der ATM bei Adipositas und im schlanken Zustand zu untersuchen.
Ein weiteres Augenmerk lag auf der Beeinflussung der Aktivierung der ATM durch Faktoren, die das Milieu im VAT bestimmen. Hier wurden in den letzten Jahren besonders Mikrogewebshypoxie und Adipokine (wie Chemerin, Leptin, Progranulin oder FABP4) als proinflammatorische Mediatoren beschrieben (O’Rourke et al. 2011; Jung und Choi 2014). Um zu untersuchen, ob ein kostimulatorischer Einfluss dieser Faktoren auf die Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ vorliegt, wurden MDM nichtadipöser Probanden mit und ohne Hypoxie bzw. ausgewählte Adipokine stimuliert. Während es unter dem Einfluss von Hypoxie zwar nicht absolut, aber dafür schon bei geringeren exCa2+-Konzentrationen zu einem Anstieg der IL-1β-Sekretion kam, konnte für die Adipokine weder nach Differenzierung mit ebenjenen und anschließender Stimulation, noch bei Kostimulation eine signifikante Veränderung in der Reaktion der MDM festgestellt werden. Für Zellen in hypoxischer Umgebung wurde eine erhöhte Expression proinflammatorischer Zytokine oder auch von CaSR beschrieben, was die Steigerung der Sensitivität gegenüber exCa2+ erklären würde (Yu et al. 2011; Pak et al. 2016). Auch hier sind weitere Studien mit komplexeren Systemen nötig, um die Abläufe in ihrer Gänze darzustellen.
Ein dritter Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der fluoreszenzmikroskopischen Darstellung der Aktivierung des NLRP3-Inflammasoms durch exCa2+ und von ASC-Specks. Das Protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD) ist Komponente des NLRP3-Inflammasoms und akkumuliert nach dessen Aktivierung im Zellplasma. Dort formt es einen Komplex, der Speck genannt wird und nach dem Zelltod umliegende Zellen stimulieren und eine Ausbreitung der Entzündung vorantreiben kann (Masumoto et al. 1999; Franklin et al. 2014). Leider gelang es im Rahmen dieser Doktorarbeit nicht, die Entstehung eines Specks zu zeigen. Nach Anfärbung von mit LPS und exCa2+ stimulierten MDM durch fluoreszenz-markierte Antikörper gegen ASC und NLRP3, konnten neben einer über die Zeit zunehmenden Expression dieser Proteine auch Strukturen gesehen werden, bei denen es sich um Specks handeln könnte. Auch wenn der Beweis dafür fehlt, stellt dies einen interessanten Ansatz dar, der in zukünftigen Studien weiter verfolgt werden sollte, besonders mit Hinblick auf die Fragen, ob im VAT bei Adipositas mehr ASC-Specks vorhanden sind, ob die Zellen adipöser und schlanker Organismen unterschiedlich darauf reagieren und ob ggf. eine Kostimulation von ASC-Specks und exCa2+ vorliegt.
Diese Arbeit trägt dazu bei, unser Verständnis der komplexen Abläufe bei Adipositas zu verbessern und die entscheidende Funktion der Fettgewebsmakrophagen in der Entstehung der Adipositas-assoziierten Entzündung zu belegen. Es konnte gezeigt werden, dass extrazelluläres Kalzium bei Adipositas einen wichtigen Einflussfaktor für die Aktivierung der Makrophagen darstellt. In Zukunft kann dies als Anknüpfungspunkt für weitere Forschungsprojekte dienen und so bei der Entwicklung neuer Medikamente und innovativer Biomarker zur Bekämpfung der stetigen Zunahme von Adipositas und der Adipositas-assoziierten Mortalität helfen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:75242 |
| Date | 29 June 2021 |
| Creators | Sommer, Miriam |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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