Hintergrund und Fragestellung:
Das NLRP3-Inflammasom ist Teil des angeborenen Immunsystems und spielt eine wichtige Rolle für pro-inflammatorische Prozesse im Rahmen der sterilen Entzündung und der Pathogenese der Atherosklerose. Das NLRP3-Inflammasom wird nicht nur durch molekulare Strukturen von Krankheitserregern, sondern auch durch endogene Gefahrensignale, wie beispielsweise oxidiertes LDL, Cholesterinkristalle, oxidativer Stress oder extrazelluläres ATP, aktiviert. Bei Aktivierung bilden sich hochmolekulare NLRP3-Inflammasomkomplexe, bestehend aus dem NLRP3-Rezeptor, dem Adapterprotein ASC und dem vom Adapterprotein gebundenen Effektorenzym Caspase-1. Im Zuge der Inflammasom-Aktivierung kommt es zur Induktion von Pyroptose, einem programmierten und mit Entzündung assoziierten Zelltod, der mit einer Porenbildung in der Zellmembran einhergeht. Dabei werden pro-inflammatorische
Zytokine in ihre bioaktiven Formen gespalten und in den extrazellulären Raum freigesetzt. Neben den Zytokinen können auch ganze Inflammasomkomplexe freigesetzt werden, wodurch diese ebenfalls in die Blutzirkulation gelangen. Die Bedeutung und Wirkung dieser extrazellulären NLRP3-Inflammasome ist noch weitgehend unbekannt. Daher wurde in den beiden wesentlichen Fragestellungen der Arbeit untersucht, ob Endothelzellen extrazelluläre Inflammasomkomplexe internalisieren und dadurch pro-atherogene Effekte ausgelöst werden können und ob zirkulierende Inflammasomkomplexe im menschlichen Blut nachgewiesen werden können.
Methoden und Ergebnisse:
Extrazelluläre Inflammasomkomplexe konnten aus Zellüberstand von mit Inflammasom-Aktivatoren behandelten humanen Monozyten isoliert werden. Mittels Western-Blot erfolgte der Nachweis des Adapterproteins ASC und des NLRP3-Rezeptors. Durch den NLRP3-Inhibitor MCC950 konnte eine Reduktion der Freisetzung von Inflammasomkomplexen in den Zellüberstand gezeigt werden. Für die Untersuchungen der Wirkung extrazellulärer Inflammasomkomplexe auf Endothelzellen wurde eine Methode zur Isolation von fluoreszenzmarkierten NLRP3-YFP-Inflammasomkomplexen aus einer stabilen NLRP3 (p.D303N)-YFP HEK-Zelllinie etabliert. Histologische Analysen zeigten, dass diese von humanen koronaren Endothelzellen aufgenommen werden können. Die immunhistochemischen Befunde bestätigten sich in der Durchflusszytometrie (Image StreamR). Die Auswertung der immunfluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen ergab, dass im Mittel 9 % ± 2,3 % der humanen umbilikalvenösen Endothelzellen und 26 % ± 9,6 % der humanen koronararteriellen Endothelzellen NLRP3-YFP-Inflammasomkomplexe internalisierten. Expressionsanalysen zeigten, dass durch die Behandlung von humanen Endothelzellen mit NLRP3-Inflammasomkomplexen eine signifikant gesteigerte Produktion des Oberflächenadhäsionsmoleküls ICAM1 induziert wird. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen waren die mRNA-Expression 2,5-fach und die Proteinlevel 6,9-fach erhöht. Die funktionelle Relevanz wurde durch den Nachweis einer vermehrten Adhäsion von Monozyten deutlich. Mit Calcein gefärbte Monozyten wurden vier Stunden mit koronararteriellen Endothelzellen inkubiert. Die anschließend photometrisch erhobenen Daten zeigten eine um 49,6% verstärkte Adhäsion von Monozyten an die vorher mit extrazellulären Inflammasomkomplexen behandelten Endothelzellen im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Die Monozytenadhäsion an das Endothel stellt einen essentiellen Schritt in der Pathogenese der Atherosklerose dar. Diese Zellkultur-Ergebnisse zeigen, dass das extrazelluläre NLRP3-Inflammasom relevanten Einfluss auf das Endothel nehmen kann.
Um die klinische Relevanz von extrazellulären NLRP3-Inflammasomen zu eruieren, wurde humanes Serum auf das Adapterprotein ASC hin untersucht. Im Rahmen dieser Dissertationsarbeit wurde die Messung von ASC bei Patienten mit Sepsis als Positivkontrolle im Vergleich zu gesunden Probanden als Negativkontrolle etabliert und validiert. Im Western-Blot konnte gezeigt werden, dass Patienten mit Sepsis mehr ASC-Komplexe aufweisen als gesunde Probanden. Dieser Befund konnte in der quantitativen Auswertung mittels ASC-ELISA bestätigt werden. Es waren signifikant höhere ASC-Konzentrationen in den Serumproben der Patienten mit Sepsis (3,2 ± 0,7 ng/ml) als in gesunden Kontrollen (0,3 ± 0,1 ng/ml) nachweisbar.
Diskussion:
Diese Ergebnisse zeigen, dass extrazelluläre NLRP3-Inflammasomkomplexe von humanen koronararteriellen Endothelzellen aufgenommen werden und dort pro-atherosklerotische Prozesse induzieren. Die erhobenen Daten weisen damit auf eine neue Domäne der zellulären Signaltransduktion hin, welche für Endothelzellen und im Rahmen der sterilen Entzündung relevant scheint. Die Messung erhöhter ASC-Spiegel im Serum von Sepsis-Patienten lässt ebenfalls eine Assoziation von Inflammasomkomplexen mit im Körper ablaufender systemischer Inflammation annehmen. Auf dem Boden der Befunde müssen weitere Studien beantworten, ob sich die Quantifizierung zirkulierender Inflammasomkomplexe als Biomarker oder zur Risikostratifizierung eignet. Des Weiteren unterstützen die Daten zukünftige Ansätze einer therapeutischen Modulation des intra- und des extrazellulären NLRP3-Inflammasoms.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:82806 |
| Date | 02 January 2023 |
| Creators | Uhlmann, Luisa |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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