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Clonagem e purificação da enzima bifuncional corismato sintase de Mycobacterium tuberculosis e caracterização cinética de sua atividade NADH:FMN-oxidorredutase

O aumento da incidência de cepas de Mycobacterium tuberculosis resistente a múltiplas drogas tornou urgente a necessidade de novos agentes terapêuticos para o tratamento da tuberculose. A via do ácido chiquímico é essencial para a sobrevivência deste organismo, o que torna suas enzimas interessantes alvos para o desenvolvimento de novos medicamentos. A enzima corismato sintase (MtCS) foi identificada no genoma de M. tuberculosis por homologia de seqüência. Esta enzima catalisa a síntese NADH- e FMN-dependente de ácido corísmico, precursor de aminoácidos aromáticos, naftoquinonas, menaquinonas e micobactinas. Este trabalho descreve a clonagem, super-expressão e purificação até a homogeneidade da MtCS recombinante. As medidas das atividades das reações de corismato sintase e de NADH:FMN oxidoredutase comprovaram a bifuncionalidade da MtCS. A atividade de flavina redutase foi caracterizada, mostrando a existência de um complexo estável entre FMNOX e MtCS. Efeitos isotópicos primários de deutério e de solvente foram realizados, e sugerem etapas distintas para a transferência do próton e para a transferência do hidreto, com o último contribuindo mais fortemente para a etapa limitante da reação. Os resultados descritos aqui auxiliarão no desenho racional de novos agentes contra tuberculose. / The emergence of multi-drug resistance Mycobacterium tuberculosis has created an urgent need for new agents to treat tuberculosis. The enzymes of shikimate pathway are attractive targets to the development of these agents, since experimental evidence that this pathway is essential for M. tuberculosis has been reported. Chorismate synthase (MtCS) has been identified by sequence homology in the genome of M. tuberculosis. This enzyme catalyzes the NADH- and FMN-dependent synthesis of chorismate, a precursor of aromatic amino acids, naphthoquinones, menaquinones, and mycobactins. In the present work, we describe MtCS cloning, overexpression and purification of recombinant protein to homogeneity. The bifunctionality of MtCS was determined by measurements both chorismate synthase and NADH:FMN oxidoreductase activities. The flavin reductase activity was characterized, showing the existence of a stable complex between FMNox and MtCS. Primary deuterium and solvent kinetic isotope effects are described and suggest distinct steps for hydride and proton transfers, with the former being more rate-limiting. These results should pave the way for the rational design of antitubercular agents.

Identiferoai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/7991
Date January 2006
CreatorsEly, Fernanda
ContributorsFrazzon, Jeverson
Source SetsIBICT Brazilian ETDs
LanguagePortuguese
Detected LanguagePortuguese
Typeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis
Formatapplication/pdf
Sourcereponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS
Rightsinfo:eu-repo/semantics/openAccess

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