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Previous issue date: 2003-09-23 / Financiadora de Estudos e Projetos / In the present work, in flow injection systems were developed for the determination of important metabolic parameters, such as 3-hydroxybutyrate, glucose and cholesterol in animal blood serum. The analysis modules were developed based on the multicommutation concept, whose main characteristics favor the processing of many samples. For this, three-way solenoid valves were used, as discreet commutation devices, for the intermittent addition of samples and reagents,
controlled by a microcomputer equipped with a commercial electronic interface (PCL-711S). The control and data acquisition programs were written in Quick BASIC 4.5. The proposed methods are based on enzymatic reactions. For these, the
enzymes were immobilized in glass beads and packed in mini-columns of acrylic (15 x 5 mm i.d.). The determination of 3-hydroxybutyrate was based on the reduction of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), forming NADH, which was monitored at 340 nm. The analytical curve of the proposed system presented a linear dependence
on concentration for concentrations between 25 and 150 mg L-1, an analytical frequency of 60 determinations per hour, relative standard deviation of 1.4% (n=17), estimated for a sample containing 75 mg L-1 of 3-hydroxybutyrate, and a detection limit of 2 mg L-1. Other observed favorable aspects were low reagent consumption of
NAD+ (0.9 mg) and 3-hydroxybutyrate dehydrogenase (8 µg), and 200 µL of sample per determination. Another analysis module was developed for glucose determination using chemiluminescence detection. The glucose was oxidized by glucose oxidase to
gluconic acid and hydrogen peroxide. The hydrogen peroxide formed reacted with the luminol, in the presence of the catalyst hexacyanoferrate (III), producing a blue luminescence at a wavelength around 420 nm. The analytical curve of the proposed system was linear for concentrations between 50 and 600 mg L-1, showed a relative
standard deviation <3.0% (n=20) for a sample containing 300 mg L-1 of glucose, a detection limit of 14.0 mg L-1, and an analytical frequency of 60 determinations per hour. The sample, hexacyanoferrate (III) and luminol consumption was 46 µL, 10.0 mg and 0.2 mg per determination, respectively. To conclude this work, the determination of cholesterol was proposed. The esters of cholesterol were hydrolyzed by cholesterol esterase to free cholesterol and fatty acid. The free cholesterol was oxidized by cholesterol oxidase to cholestenone and hydrogen
peroxide. The hydrogen peroxide reacted with luminol and hexacyanoferrate (III), being detected by chemiluminescence. The proposed system presented an analytic frequency of 40 determinations per hour, relative standard deviation of 2.3% (n=20) for a sample containing 75 mg L-1 of cholesterol, a linear dependence in the concentration range of 25 and 125 mg L-1, and an estimated detection limit of 3.7 mg L-1. The reagent consumption was 0.22 mg of luminol and 2.75 mg of hexacyanoferrate (III) per determination. Once the best analysis conditions were found, a set of samples was analyzed using the three proposed systems. Applying the t test among the results obtained with the proposed systems and those obtained with the manual procedures of analysis (kit), no significant difference was observed at the 95% confidence level. / No presente trabalho projetaram-se sistemas de injeção em fluxo visando a determinação de importantes parâmetros metabólicos, como
3-hidroxibutirato, glicose e colesterol, em soro de sangue animal. Os módulos de análise foram desenvolvidos baseando-se no conceito de multicomutação, cujas características principais favorecem o processamento de elevado número de
amostra. Para isso, utilizaram-se válvulas solenóides de três vias, dispositivos de comutação discreta, para a adição intermitente de amostras e reagentes, controladas por um microcomputador equipado com uma interface eletrônica comercial (PCL-711S). Os programas para controle e aquisição de dados foram escritos em linguagem Quick BASIC 4.5. Os métodos propostos basearam-se em reações enzimáticas. Para isso, as enzimas foram imobilizadas em esferas de vidro e acondicionadas em mini-colunas de acrílico (15 x 5 mm d.i.). A determinação de 3-hidroxibutirato baseou-se na redução de dinucleotídeo adenina nicotinamida (NAD+), formando o produto NADH, que foi monitorado em 340 nm. A curva analítica
do sistema proposto apresentou faixa linear de concentração entre 25 e 150 mg L-1, freqüência analítica de 60 determinações por hora, desvio padrão relativo de 1,4% (n=17), estimado para uma amostra contendo 75 mg L-1 de 3-hidroxibutirato, e limite de detecção de 2 mg L-1. Outros aspectos favoráveis observados foram baixo consumo de reagente NAD+ (0,9 mg) e 3-hidroxibutirato desidrogenase (8 µg), e 200 µL de amostra por determinação. Outro módulo de análises foi desenvolvido para a determinação de glicose por detecção quimiluminescente. A glicose foi oxidada pela glicose oxidase a ácido glucónico e peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio formado reagia com o luminol, na presença do catalisador hexacianoferrato (III), produzindo uma luminescência azul com comprimento de onda
em torno de 420 nm. A curva analítica do sistema proposto apresentou faixa linear de concentração entre 50 e 600 mg L-1, desvio padrão relativo < 3,0% (n=20) para amostra contendo 300 mg L-1 de glicose, limite de detecção de 14,0 mg L-1, e
freqüência analítica de 60 determinações por hora. O consumo de amostra, hexacianoferrato (III) e luminol foram de 46 µL, 10,0 mg e 0,2 mg por determinação, respectivamente. Para finalizar este trabalho, foi proposta a determinação de colesterol. Os ésteres de colesterol foram hidrolisados pela colesterol esterase a colesterol livre e ácidos graxos. O colesterol livre foi oxidado pela colesterol oxidase a colestenona e peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio reagia com luminol e hexacianoferrato (III), sendo detectado por quimiluminescência. O sistema proposto apresentou freqüência analítica de 40 determinações por hora, desvio padrão relativo de 2,3% (n=20) para amostra contendo 75 mg L-1 de colesterol,
linearidade na faixa de concentração entre 25 e 125 mg L-1 e limite de detecção estimado em 3,7 mg L-1. O consumo de reagentes foi de 0,22 mg de luminol e 2,75 mg de hexacianoferrato (III) por determinação. Uma vez definidas as melhores
condições de análise, um conjunto de amostras foi analisado empregando os três sistemas propostos. Aplicando-se o teste t entre os resultados obtidos com os sistemas propostos e aqueles obtidos com os procedimentos manuais de análises (kit), não foi observada diferença significativa em nível de 95% de confiança.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/6361 |
| Date | 23 September 2003 |
| Creators | Pires, Cherrine Kelce |
| Contributors | Reis, Boaventura Freire dos |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Programa de Pós-graduação em Química, UFSCar, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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