Les metalotioneïnes (MT) són unes proteïnes de baix pes molecular i elevat contingut en residus de cisteïna que es caracteritzen per la seva extremada habilitat para enllaçar tant cations de metalls essencials, com Zn(II) i Cu(I), com de metalls tòxics (Cd(II), Hg(II)).En una primera part d'aquest treball s'analitza la utilització del catió Ag(I) com a sonda del catió Cu(I) en l'estudi de les Cu-MT, i en conseqüència es compara detalladament el comportament d'ambdós metalls enfront la isoforma 1 de MT de mamífer. Aquesta proteïna, així com els seus fragments constitutius a i b, s'ha obtingut per enginyeria genètica amb la finalitat d'assegurar al màxim el seu grau de puresa. L'estudi de la capacitat coordinant de MT 1, aMT 1 i bMT 1 enfront Ag(I) s'ha dut a terme mitjançant tècniques d'espectroscòpia electrònica (CD i UV-Vis) i de masses (ESI-MS). Aquesta darrera tècnica ha requerit la incorporació d'un mètode de separació previ a la determinació de la massa, per tal d'eliminar la presència de tampó a la mostra. L'electroforesi capil·lar (CZE) acoblada a l'ESI-MS ha demostrat ser una bona opció.Amb la finalitat de validar l'acoblament CZE-ESI-MS, en primer lloc s'ha aplicat l'esmentat acoblament a l'estudi del desplaçament del Zn(II) en Zn7-MT 1 per Cd(II) a pH 7, procés ja conegut en les MT de mamífer que procedeix de manera seqüencial i isomorfa. Aquest estudi demostra que la tècnica CZE permet una bona separació del tampó de la solució que conté la proteïna, a la vegada que ofereix una detecció precisa de l'estequiometria de les espècies que coexisteixen en solució. En base a aquests resultats, s'ha seguit en paral·lel -mitjançant CD, UV-Vis i CZE-ESI-MS- la valoració de Zn7-MT 1, Zn4-aMT 1 i Zn3-bMT 1 amb AgClO4 a pH 7.5 i 2.5. Els resultats mostren que al llarg de les valoracions es forma un elevat nombre d'espècies, tant heterometàl·liques AgxZny-MT com homometàl·liques Agx-MT, i que en la majoria dels punts de valoració coexisteixen diverses espècies. També s'ha observat que el zinc exerceix un efecte plantilla en les 3 proteïnes estudiades, ja que el grau d'estructuració d'espècies Ag-MT de la mateixa estequiometria depèn de manera important de que l'espècie inicial sigui Zn-MT o apo-MT. La comparació Ag-Cu permet concloure que els únics casos en què l'ió Ag(I) es podria utilitzar com a substitut de Cu(I) sense causar alteracions estructurals significatives es dóna en les espècies heterometàl·liques M4Zn5-MT i M7Zn3-MT (M= Ag, Cu).En la segona part del treball s'ha estudiat una nova MT de Drosophila melanogaster, denominada MTO, amb l'objectiu de contribuir a un criteri funcional de classificació de les MT en Zn- o Cu-tioneïna. La proteïna MTO, que disposa de 12 Cys en la seva cadena aminoacídica, es biosintetitza com a Zn4-MTO en medis rics en Zn, mentre que en medis enriquits en Cu s'obté l'espècie Cu9-MTO. El conjunt de resultats, tant in vivo com in vitro, permet classificar la MTO com una Cu-tioneïna, es a dir, amb preferència coordinativa respecte aquest metall en medis fisiològics. També, per primera vegada s'han aportat evidències estructurals sobre la participació dels ions clorur en la coordinació d'ions metàl·lics en MT, concretament en les espècies M4-MTO (M = Zn, Cd). / Metallothioneins (MT) are ubiquitous low molecular weight cysteine-rich metalloproteins, which characterize by their extremely high binding abilities towards essential metal cations, such as Zn(II) and Cu(I), as well as toxic cations like Cd(II) and Hg(II). In the first stage of this work the use of Ag(I) as a probe for Cu(I) in Cu-MT studies is analysed, and thus, the behaviour of both metal ions when binding to the mammalian MT 1 isoform has been compared. This protein, as well as their constitutive a and b fragments, was obtained by genetic engineering in order to assure the highest purity degree. The binding abilities of Ag(I) to MT 1, aMT 1 and bMT 1 have been studied by using optical spectroscopy (CD, UV-vis) and mass spectrometry (ESI-MS) techniques. The latter required the use of a separation method previous to the mass determination in order to remove the buffer present in the sample.With the aim of validating the CZE-ESI-MS coupling, we first studied the Zn(II)/Cd(II) replacement in Zn7-MT 1 at pH 7, a well known system in mammalian MT that proceeds by means of a sequential and isomorphous Zn/Cd replacement. This study proves that the previous coupling allow a good separation of the protein from the buffer, while achieving a precise detection of the stoichiometries of the coexisting species in solution. Based on these results, the titrations of Zn7-MT 1, Zn4-aMT 1 and Zn3-bMT 1 with AgClO4 at pH 7.5 and 2.5 were monitored in parallel by CD, UV-vis and CZE-ESI-MS techniques. The results obtained throughout the titration show formation of a high number of heterometallic AgxZny-MT as well as homometallic Agx-MT species. Also, at each titration point, there is coexistence of several species. It has also been shown the Zn template effect in the 3 proteins studied as revealed by the different folding found for the Ag-MT species of the same stoichiometry formed either from Zn-MT or from apo-MT. Comparison of the behaviour of Ag(I) and Cu(I) toward mammalian MT 1 allows us to conclude that the only cases in which the Ag(I) ion can be used as a probe for Cu(I) without causing significant structural alterations are in the heterometallic M4Zn5-MT and M7Zn3-MT (M= Ag, Cu) species.In the second stage of this work, a new Drosophila melanogaster MT, named MTO, has been studied with the aim of contributing to a new functional criterion of classifying MT as Zn- or Cu-thioneins. The MTO protein, which includes 12 Cys residues in the aminoacidic chain, was biosynthesised as Zn4-MTO in a Zn enriched media, while in a Cu supplemented media the Cu9-MTO species was obtained. The overall results, both in vivo and in vitro, allow us to propose classification of MTO as a Cu-thionein, in agreement with the coordination preference shown by the protein toward this metal ion. Furthermore, unprecedented structural evidences showing the participation of chloride ions as ligands of the metal ions in MT is reported. This was found in the case of M4-MTO (M = Zn, Cd) species.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3159 |
| Date | 15 May 2003 |
| Creators | Palacios Bonilla, Òscar |
| Contributors | Capdevila, Mercè, González Duarte, Pilar, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Química |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0027 seconds