Orientador: Maria Lígia Rodrigues Macedo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T06:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2014 / Resumo: Os inibidores de proteinases extraídos de plantas têm se mostrado promissores como um método alternativo no combate aos insetos-pragas. Neste estudo, um inibidor de peptidase foi isolado de sementes de Clitoria fairchildiana (Papilionoideae), denominado CFPI, caracterizado funcional e estruturalmente e sua atividade inseticida foi avaliada. CFPI foi purificado por exclusão molecular, seguido por coluna de interação hidrofóbica e apresentou um pico majoritário com atividade inibitória após ter sido submetido à filtração com alta resolução. Estudos cinéticos realizados com CFPI purificado mostraram uma atividade inibitória do tipo competitiva contra tripsina e quimotripsina bovinas, com uma estequiometria de inibição de 1:1 para ambas as enzimas. A constante de inibição de CFPI contra tripsina e quimotripsina bovinas foram 3,3 x 10-10 e 1,5 x 10-10 M, respectivamente, revelando uma forte capacidade de ligação. Eletroforese em SDS-Page mostrou que CFPI possui uma única cadeia polipeptídica, com uma massa molecular aparente de 15 kDa, sob condições não redutoras. Entretanto, o inibidor apresentou uma massa acurada de 7973 Daltons determinada por MALDI-TOF, sugerindo que CFPI forme dímeros em solução. Essa característica, aliada à estequiometria de inibição para tripsina e quimotripsina, à constante de inibição (Ki) para ambas as enzimas e ao sequenciamento e alinhamento N-terminal, permitiram classificar CFPI como membro da família Bowman-Birk de inibidores. O inibidor manteve-se estável ao aquecimento progressivo por 30 min a cada temperatura, variando de 37 até 100 ?C e a análise de dicroísmo não mostrou mudanças no espectro a 207 nm após aquecimento à 90 ?C e subsequente resfriamento. Além disso, CFPI mostrou atividade sobre uma ampla faixa de pH (2-10). Em contraste, a redução de CFPI com DTT resultou em perda de atividade inibitória contra tripsina e quimotripsina. CFPI exibiu atividade inibitória considerável contra enzimas tripsinas de Anagasta kuehniella (76%), Diatraea saccharalis (59%) e Heliothis virescens (49%). Suas propriedades inseticidas foram confirmadas a partir do impacto negativo causado no crescimento de A. kuehniella e C. cephalonica. O inibidor exerceu efeito antinutricional sobre A. kuehniella tanto na geração F0 como em F1 / Abstract: Proteinase inhibitors isolated from plants have shown a promising alternative method against insect pests. In this study, a proteinase inhibitor was isolated from Clitoria fairchildiana seeds (CFPI). CFPI was functional and structurally characterized and its insecticidal activity was evaluated. CFPI was purified by molecular exclusion, following by hydrophobic interaction column and showed a majoritarian peak with inhibitory activity after high resolution filtration gel column. Kinetic studies of the purified inhibitor showed a competitive¿type inhibitory activity against bovine trypsin and chymotrypsin, with an inhibition stoichiometry of 1:1 for both enzymes. The inhibition constants against trypsin and chymotrypsin were 3.3 ×10?10 and 1.5 × 10?10 M, respectively, displaying a tight binding property. SDS¿PAGE showed that CFPI has a single polypeptide chain with an apparent molecular mass of 15 kDa under non¿reducing conditions. However, MALDI¿TOF analysis demonstrated a molecular mass of 7.973 Da, suggesting that CFPI forms dimers in solution. This feature, combined with the stoichiometry of inhibition for trypsin and chymotrypsin, the inhibition constant (Ki) for both enzymes and the N-terminal sequencing, allowed classifying CFPI as a member of Bowman-Birk family inhibitors. CFPI remained stable to progressive heating for 30 min to each temperature range of 37 up to 100 °C and CD analysis exhibited no changes in spectra at 207 nm after heating at 90 °C and subsequent cooling. Moreover, CFPI was active over a wide pH range (2¿10). In contrast, reduction with DTT resulted in a loss of inhibitory activity against trypsin and chymotrypsin. CFPI also exhibited remarkable inhibitory activity against larval midgut trypsin enzymes from Anagasta kuehniella (76%), Diatraea saccharalis (59%) and Heliothis virescens (49%). Its insecticidal properties were further analysed by bioassays and confirmed by negative impact on growth of A. kuehniella and C. cephalonica. The inhibitor exhibited antinutritional effect on A. kuehniella in the F0 and F1 generations / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unicamp.br:REPOSIP/314532 |
| Date | 26 August 2018 |
| Creators | Dantzger, Miriam, 1981- |
| Contributors | UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS, Macedo, Maria Lígia Rodrigues, Werneck, Claudio Chrysostomo, Souza, Alessandra Alves de, Rocha, Adriana Rios Lopes, Labate, Carlos Alberto |
| Publisher | [s.n.], Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia, Programa de Pós-Graduação em Biologia Funcional e Molecular |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 143 p. : il., application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da Unicamp, instname:Universidade Estadual de Campinas, instacron:UNICAMP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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