A flor se caracteriza como um ramo altamente modificado, especializado na reprodução das angiospermas. Por ser responsável por um processo tão crucial no ciclo de vida das plantas, o desenvolvimento das flores é estritamente regulado por vias genéticas e sinais ambientais que controlam a transição da fase vegetativa para fase reprodutiva. Esse controle culmina na determinação no meristema floral, o qual se diferenciará nos quatro verticilos florais: sépalas, pétalas, estames e pistilo. Dentre os quatro verticilos, os estames e o pistilo são os órgãos responsáveis pela reprodução, logo é de suma importância compreender mecanismos moleculares responsáveis pelo correto desenvolvimento desses órgãos. Com o intuito de melhor compreender o desenvolvimento do pistilo, nosso grupo de pesquisa fez a caracterização inicial de um gene preferencialmente expresso no pistilo de Nicotiana tabacum, que controla a proliferação celular nesse órgão e foi denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1). No entanto, seu mecanismo de ação ainda não foi elucidado. Avanços nas investigações tem revelado uma extensa rede de proteínas com as quais SCI1 interage, o que permitiu assumir que SCI1 está envolvido em vias de processamento de RNA e no ciclo celular. Seu envolvimento em processos celulares básicos, levantou a hipótese de uma possível expressão no início do desenvolvimento floral. Portanto, este trabalho teve por objetivos determinar onde e quando o gene SCI1 inicia sua expressão em flores de Nicotiana tabacum; relacionar a expressão de SCI1 com o desenvolvimento do pistilo; e analisar a regulação transcricional de SCI1. Através da hibridização in situ foi possível determinar que SCI1 inicia sua expressão no meristema floral e segue se expressando intensamente nos primórdios iniciais dos verticilos florais. A expressão de SCI1 no meristema floral e primórdios dos verticilos indica que este gene pode estar envolvido no desenvolvimento de todos os verticilos florais. A medida que os verticilos se especificam, a expressão de SCI1 é reduzida, exceto no pistilo, órgão em que se localizam as últimas células meristemáticas a se diferenciarem. O mRNA de SCI1 foi detectado tanto nos carpelos não fusionados, quanto já fusionados. A hibridização in situ também revelou a coexpressão de SCI1 com o gene NAG1 no meristema floral, nos verticilos dos estames e carpelos. NAG1 codifica um fator de transcrição responsável pela especificação do terceiro e quarto verticilos florais e SCI1 foi descrito como um gene que controla o desenvolvimento de estigmaxv e estilete, estruturas que fazem parte do quarto verticilo, logo essa co-expressão revela uma possível interação desse fator de transcrição com o promotor de SCI1. Essa interação foi predita in silico e confirmada em ensaio de mono híbrido (Yeast One Hybrid) com uma porção do promotor de SCI1, denominada frag1, que compreende 443pb acima do códon de iniciação (ATG). Análises in silico também encontraram um putativo sítio para a interação do fator de transcrição WUSCHEL nesse mesmo fragmento, no entanto os resultados obtidos nos ensaios de mono híbrido para esta interação foram inconclusivos. Plantas transgênicas expressando a proteína SCI1 em fusão traducional a GFP, sob controle do promotor endógeno de SCI1, foram capazes de reproduzir a expressão endógena desse gene e possibilitaram determinar a localização da proteína. Como o mRNA, a proteína SCI1 é encontrada a partir do meristema floral e em todos os verticilos florais. A medida que a flor se desenvolvia, a proteína foi reduzindo sua quantidade de maneira centrípeta nos verticilos, no entanto essa redução não foi observada no pistilo até o estádio 2, estádio em que foi possível a observação (devido ao tamanho da flor). Nessas plantas também foi possível detectar a proteína SCI1 nos tecidos especializados do estilete e estigma, tecido transmissor do estilete e zona secretória do estigma, respectivamente, assim como nas células do parênquima. Essas plantas também possibilitaram observar a proteína nos óvulos e confirmar sua localização em núcleo e nucléolo. Esse conjunto de dados confirmam a hipótese da expressão de SCI1 no meristema floral. Além disso, os resultados demonstram que a expressão de SCI1 é regulada diretamente pelo fator de transcrição NAG1 / The flower is characterized as a highly modified branch, specialized in the reproduction of angiosperms. Since it is responsible for such a crucial process in the life cycle of plants, flower development is strictly regulated by genetic pathways and environmental signals that control the transition from the vegetative phase to the reproductive phase. This control culminates in the floral meristem determination, which will differentiate in the four flower whorls: sepals, petals, stamens and pistil. Among the four whorls, stamens and pistil are the organs responsible for reproduction, so it is extremely important to understand the molecular mechanisms responsible for the correct development of these organs. In order to better understand the development of pistil, our research group made the initial characterization of a gene preferentially expressed in the pistil of Nicotiana tabacum, which controls cell proliferation in this organ and was denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1). However, its mechanism of action has not yet been elucidated. Advances in the investigations have revealed an extensive network of proteins with which SCI1 interacts, which has allowed to assume that SCI1 is involved in RNA processing pathways and in the cell cycle. Its involvement in basic cellular processes, raised the hypothesis of a possible expression at the beginning of floral development. Therefore, this work had as objectives to determine where and when the SCI1 gene starts its expression in flowers of Nicotiana tabacum; to correlate SCI1 expression to pistil development; and to analyze the transcriptional regulation of SCI1. Through in situ hybridization, it was possible to determine that SCI1 starts its expression in the floral meristem and continues to express intensely in the early primordia of floral whorls. The expression of SCI1 in floral meristem and whorl primordia indicates that this gene may be involved in the development of all floral whorls. As the whorls are specified, the expression of SCI1 is reduced, except in the pistil, organ in which the last meristematic cells are located. SCI1 mRNA was detected in both unfused and fused carpels. In situ hybridization also revealed the co-expression of SCI1 with the NAG1 gene in the floral meristem, in the whorls of stamens and carpels. NAG1 encodes a transcription factor responsible for the specification of the third and fourth floral whorls and SCI1 was described as a gene that controls the development of stigma and style, structures that are part of the fourth whorl, so this co-expression reveals a possible interaction of this transcription factor with the SCI1 promoter. This interaction was predicted in silico and confirmed in a Yeast One Hybrid assay with a portion of the SCI1 promoter, called frag1, comprising 443bp upstream the initiation codon (ATG). In silico analyzes also found a putative site for the interaction of the WUSCHEL transcription factor in this same fragment, however the results obtained in Yeast One Hybrid assays for this interaction were inconclusive. Transgenic plants expressing the SCI1 protein in translational fusion to GFP, under the control of the endogenous SCI1 promoter, were able to reproduce the endogenous expression of this gene and enabled to determine the location of the protein. Like the mRNA, the SCI1 protein is found since the floral meristem and on all floral whorls. As the flower developed, the protein was reducing its amount in a centripetal way in the whorls, however this reduction was not observed in the pistil until the stage 2, the last stage in which the observation was possible (due to the size of the flower). In these plants it was also possible to detect the SCI1 protein in the specialized tissues of style and stigma, stylar transmitting tissue and stigmatic secretory zone, respectively, as well as in the parenchyma cells. These plants also allowed the observation of the protein in ovules and to confirm its localization in nucleus and nucleolus. This data set confirms the hypothesis of SCI1 expression in floral meristem. In addition, the results demonstrate that SCI1 expression is directly regulated by the transcription factor NAG1
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29102018-153741 |
| Date | 21 June 2018 |
| Creators | Cruz, Joelma de Oliveira |
| Contributors | Goldman, Maria Helena de Souza |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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