A modulação da forma e tamanho em órgãos vegetais depende do controle temporal e espacial de divisão e expansão celular. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que regulam este processo durante o desenvolvimento floral. O estudo da via de sinalização de SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) pode contribuir para o entendimento do processo de crescimento das flores. Este gene produz uma proteína, localizada no nucléolo, que está relacionada à inibição da proliferação celular no estigma e no estilete de Nicotiana tabacum, modulando o tamanho destes órgãos florais. Experimentos feitos para a identificação de parceiros de interação de SCI1 identificaram as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum como candidatas à interação. A família 14-3-3 é composta de proteínas altamente conservadas, que formam dímeros em sua conformação nativa e são responsáveis pela modulação da atividade das mais variadas proteínas em resposta a sinais intracelulares. Por isso, estas proteínas estão associadas à regulação de uma série de processos, incluindo o metabolismo, transcrição, ciclo celular, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum e o seu papel durante o desenvolvimento floral. Os resultados aqui obtidos revelaram que a 14-3-3A possui localização citoplasmática e nuclear, enquanto a 14-3-3D se distribui apenas no citoplasma. Também foi evidenciado que estas proteínas são capazes de formar homodímeros e heterodímeros entre si. Os homodímeros de 14-3-3A estão distribuídos no citoplasma e no núcleo, enquanto os homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros se encontram apenas no citoplasma. Adicionalmente, a interação in vivo entre a 14-3-3A e SCI1 foi confirmada por BiFC, apresentando localização nuclear, fora do nucléolo. Análises in silico da sequência de aminoácidos de SCI1 identificaram duas regiões putativas de reconhecimento por proteínas 14-3-3s. Estas regiões estão sendo analisadas funcionalmente por meio de ensaios de BiFC com sequências mutadas de SCI1. A análise deste conjunto de resultados, juntamente com outros resultados obtidos em nosso laboratório, sugere que apenas homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros formados entre 14-3-3A e 14-3-3D sejam capazes de interagir com SCI1. Adicionalmente, a localização nuclear dessa interação difere daquelas observadas para SCI1 e para as 14-3-3s individualmente, sugerindo que as 14-3-3s migrem para o núcleo para interagir com SCI1. Nossa hipótese é de que as proteínas 14-3-3s possam modular a localização subnuclear de SCI1. Com o objetivo de levantar dados a respeito das possíveis funções desempenhadas pelas proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum, foram identificados os grupos de possíveis ortólogos dessas proteínas em A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum e N. benthamiana. Esta análise mostrou que os ortólogos às 14-3-3A e D em Arabidopsis estão associados ao ciclo celular, o que sugere que as proteínas de tabaco possam ter conservado essa função. Além disso, também foram produzidas plantas transgênicas silenciadas para cada uma dessas 14-3-3s de maneira independente. A análise dos fenótipos das plantas transgênicas não levou à elaboração de uma hipótese definitiva sobre a função dessas 14-3-3s no desenvolvimento floral. No entanto, algumas plantas transgênicas apresentaram estruturas menores, especialmente as pétalas, sugerindo que estas proteínas podem estar envolvidas no controle do tamanho de órgãos vegetais. / The modulation of size and shape in plant organs depends on temporal and spatial control of cell division and expansion. However, the molecular mechanisms that regulate this process during floral development are poorly understood. The study of SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) signaling pathway can contribute to the understanding of the flower growing process. This gene produces a protein which is located in the nucleolus and is related to the inhibition of cell proliferation in the Nicotiana tabacum stigma and style, modulating the size of these organs. Experiments performed to identify SCI1 interaction partners have identified the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins as interaction candidates. The 14-3-3 family is composed of highly conserved proteins, which form dimers in their native conformation and are responsible to modulate the activity of a large variety of proteins in response to intracellular signals. Therefore, these proteins are associated to the regulation of several processes, including metabolism, transcription, and cell cycle, among others. In this context, the present work aimed to study the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins and their role during flower development. The results here obtained revealed that 14-3-3A is located in the nucleus and the cytosol, while 14-3-3D protein is distributed only in the cytosol. It was also shown that these proteins can form homodimers and heterodimers with each other. Homodimers of 14-3-3A are distributed in nucleus and cytosol, while 14-3-3D homodimers and heterodimers are located only in the cytosol. Furthermore, the in vivo interaction between SCI1 and 14-3-3A was confirmed by BiFC, showing nuclear localization, outside the nucleolus. In silico analyzes of SCI1 amino acid sequence identified two putative regions of recognition by 14-3-3 proteins. These regions are being evaluated by BiFC assays with SCI1 mutated sequences. The analyses of this set of results, together with other results obtained in our laboratory, suggests that only 14-3-3D homodimers and heterodimers between 14-3-3A and 14-3-3D are capable to interact with SCI1. Moreover, the nuclear localization of this interaction differs from the ones observed for SCI1 and for the 14-3-3s individually, which suggests that the 14-3-3s migrate to the nucleus to interact with SCI1. Our hypothesis is that the 14-3-3 proteins can modulate the subnuclear localization of SCI1. To obtain data concerning the possible roles of the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins, groups of possible orthologous of these proteins in A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum and N. benthamiana were identified. This analysis has shown that the orthologs of 14-3-3A and D in Arabidopsis are associated to the cell cycle, suggesting that the tobacco proteins might have conserved this function. Furthermore, transgenic plants silenced for each of the 14-3-3s independently were also produced. Phenotype analyzes of transgenic plants did not lead to a definitive hypothesis about the function of these 14-3-3s during floral development. However, some transgenic plants exhibited smaller structures, specially petals, which suggests that these proteins may be involved in the size control of plant organs.

A flor se caracteriza como um ramo altamente modificado, especializado na reprodução das angiospermas. Por ser responsável por um processo tão crucial no ciclo de vida das plantas, o desenvolvimento das flores é estritamente regulado por vias genéticas e sinais ambientais que controlam a transição da fase vegetativa para fase reprodutiva. Esse controle culmina na determinação no meristema floral, o qual se diferenciará nos quatro verticilos florais: sépalas, pétalas, estames e pistilo. Dentre os quatro verticilos, os estames e o pistilo são os órgãos responsáveis pela reprodução, logo é de suma importância compreender mecanismos moleculares responsáveis pelo correto desenvolvimento desses órgãos. Com o intuito de melhor compreender o desenvolvimento do pistilo, nosso grupo de pesquisa fez a caracterização inicial de um gene preferencialmente expresso no pistilo de Nicotiana tabacum, que controla a proliferação celular nesse órgão e foi denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1). No entanto, seu mecanismo de ação ainda não foi elucidado. Avanços nas investigações tem revelado uma extensa rede de proteínas com as quais SCI1 interage, o que permitiu assumir que SCI1 está envolvido em vias de processamento de RNA e no ciclo celular. Seu envolvimento em processos celulares básicos, levantou a hipótese de uma possível expressão no início do desenvolvimento floral. Portanto, este trabalho teve por objetivos determinar onde e quando o gene SCI1 inicia sua expressão em flores de Nicotiana tabacum; relacionar a expressão de SCI1 com o desenvolvimento do pistilo; e analisar a regulação transcricional de SCI1. Através da hibridização in situ foi possível determinar que SCI1 inicia sua expressão no meristema floral e segue se expressando intensamente nos primórdios iniciais dos verticilos florais. A expressão de SCI1 no meristema floral e primórdios dos verticilos indica que este gene pode estar envolvido no desenvolvimento de todos os verticilos florais. A medida que os verticilos se especificam, a expressão de SCI1 é reduzida, exceto no pistilo, órgão em que se localizam as últimas células meristemáticas a se diferenciarem. O mRNA de SCI1 foi detectado tanto nos carpelos não fusionados, quanto já fusionados. A hibridização in situ também revelou a coexpressão de SCI1 com o gene NAG1 no meristema floral, nos verticilos dos estames e carpelos. NAG1 codifica um fator de transcrição responsável pela especificação do terceiro e quarto verticilos florais e SCI1 foi descrito como um gene que controla o desenvolvimento de estigmaxv e estilete, estruturas que fazem parte do quarto verticilo, logo essa co-expressão revela uma possível interação desse fator de transcrição com o promotor de SCI1. Essa interação foi predita in silico e confirmada em ensaio de mono híbrido (Yeast One Hybrid) com uma porção do promotor de SCI1, denominada frag1, que compreende 443pb acima do códon de iniciação (ATG). Análises in silico também encontraram um putativo sítio para a interação do fator de transcrição WUSCHEL nesse mesmo fragmento, no entanto os resultados obtidos nos ensaios de mono híbrido para esta interação foram inconclusivos. Plantas transgênicas expressando a proteína SCI1 em fusão traducional a GFP, sob controle do promotor endógeno de SCI1, foram capazes de reproduzir a expressão endógena desse gene e possibilitaram determinar a localização da proteína. Como o mRNA, a proteína SCI1 é encontrada a partir do meristema floral e em todos os verticilos florais. A medida que a flor se desenvolvia, a proteína foi reduzindo sua quantidade de maneira centrípeta nos verticilos, no entanto essa redução não foi observada no pistilo até o estádio 2, estádio em que foi possível a observação (devido ao tamanho da flor). Nessas plantas também foi possível detectar a proteína SCI1 nos tecidos especializados do estilete e estigma, tecido transmissor do estilete e zona secretória do estigma, respectivamente, assim como nas células do parênquima. Essas plantas também possibilitaram observar a proteína nos óvulos e confirmar sua localização em núcleo e nucléolo. Esse conjunto de dados confirmam a hipótese da expressão de SCI1 no meristema floral. Além disso, os resultados demonstram que a expressão de SCI1 é regulada diretamente pelo fator de transcrição NAG1 / The flower is characterized as a highly modified branch, specialized in the reproduction of angiosperms. Since it is responsible for such a crucial process in the life cycle of plants, flower development is strictly regulated by genetic pathways and environmental signals that control the transition from the vegetative phase to the reproductive phase. This control culminates in the floral meristem determination, which will differentiate in the four flower whorls: sepals, petals, stamens and pistil. Among the four whorls, stamens and pistil are the organs responsible for reproduction, so it is extremely important to understand the molecular mechanisms responsible for the correct development of these organs. In order to better understand the development of pistil, our research group made the initial characterization of a gene preferentially expressed in the pistil of Nicotiana tabacum, which controls cell proliferation in this organ and was denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1). However, its mechanism of action has not yet been elucidated. Advances in the investigations have revealed an extensive network of proteins with which SCI1 interacts, which has allowed to assume that SCI1 is involved in RNA processing pathways and in the cell cycle. Its involvement in basic cellular processes, raised the hypothesis of a possible expression at the beginning of floral development. Therefore, this work had as objectives to determine where and when the SCI1 gene starts its expression in flowers of Nicotiana tabacum; to correlate SCI1 expression to pistil development; and to analyze the transcriptional regulation of SCI1. Through in situ hybridization, it was possible to determine that SCI1 starts its expression in the floral meristem and continues to express intensely in the early primordia of floral whorls. The expression of SCI1 in floral meristem and whorl primordia indicates that this gene may be involved in the development of all floral whorls. As the whorls are specified, the expression of SCI1 is reduced, except in the pistil, organ in which the last meristematic cells are located. SCI1 mRNA was detected in both unfused and fused carpels. In situ hybridization also revealed the co-expression of SCI1 with the NAG1 gene in the floral meristem, in the whorls of stamens and carpels. NAG1 encodes a transcription factor responsible for the specification of the third and fourth floral whorls and SCI1 was described as a gene that controls the development of stigma and style, structures that are part of the fourth whorl, so this co-expression reveals a possible interaction of this transcription factor with the SCI1 promoter. This interaction was predicted in silico and confirmed in a Yeast One Hybrid assay with a portion of the SCI1 promoter, called frag1, comprising 443bp upstream the initiation codon (ATG). In silico analyzes also found a putative site for the interaction of the WUSCHEL transcription factor in this same fragment, however the results obtained in Yeast One Hybrid assays for this interaction were inconclusive. Transgenic plants expressing the SCI1 protein in translational fusion to GFP, under the control of the endogenous SCI1 promoter, were able to reproduce the endogenous expression of this gene and enabled to determine the location of the protein. Like the mRNA, the SCI1 protein is found since the floral meristem and on all floral whorls. As the flower developed, the protein was reducing its amount in a centripetal way in the whorls, however this reduction was not observed in the pistil until the stage 2, the last stage in which the observation was possible (due to the size of the flower). In these plants it was also possible to detect the SCI1 protein in the specialized tissues of style and stigma, stylar transmitting tissue and stigmatic secretory zone, respectively, as well as in the parenchyma cells. These plants also allowed the observation of the protein in ovules and to confirm its localization in nucleus and nucleolus. This data set confirms the hypothesis of SCI1 expression in floral meristem. In addition, the results demonstrate that SCI1 expression is directly regulated by the transcription factor NAG1

Os estudos em reprodução e desenvolvimento das plantas, especialmente voltados ao pistilo, são de grande interesse agronômico, econômico e científico. Em nosso laboratório, recentemente, foi identificado e caracterizado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), um inibidor do ciclo celular que atua de forma tecido específica no pistilo de Nicotiana tabacum L. e Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). Foi identificada a proteína NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase 2) como parceira de interação de NtSCI1 (N . tabacum SCI1), em um ensaio de pull-down (STRINI, 2014). A literatura aponta que os inibidores de ciclo celular regulam o ciclo através da inibição de CDK, o que sugere que NtSCI1 possa regular o ciclo celular através da inibição de NtCDKG;2. O presente estudo mostra análises detalhadas da localização de GFP-NtCDKG;2 em células epiteliais de N. benthamiana. Verificou-se que a proteína NtCDKG;2 está presente no nucleoplasma e também co-localiza em speckles nucleares. Em cultura de células BY2 expressando GFP-NtCDKG;2 de forma estável, foi observado que, durante a metáfase e anáfase, a proteína NtCDKG;2 está junto ao fuso acromático. Adicionalmente, ensaios de BiFC (Bi-molecular Fluorescence Complementation) realizados neste trabalho mostram que a interação entre as proteínas NtCDKG;2 e NtSCI1 ocorre em uma região localizada na periferia nucleolar, durante a interfase. Também foram identificadas possíveis isoformas de NtCDKG;2. A possibilidade da ocorrência de isoformas sugere que, de maneira análoga à sua homóloga em humanos, as isoformas resultantes de NtCDKG;2 possam atuar em diferentes processos. Em busca de parceiros de interação de NtCDKG;2, para identificar em que vias esta proteína atua, foi realizado um screening de uma biblioteca de cDNAs de estigmas e estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido em leveduras (Y2H). Através desse ensaio, foram identificados diversos parceiros envolvidos com transcrição e processamento de RNA. Dentre as proteínas identificadas, cuja interação foi confirmada neste trabalho, destaca-se a proteína NtCDKF;1, uma proteína que fosforila o CTD da RNA Polimerase II e, dessa forma, auxilia a transcrição e o splicing cotranscricional (HAJHEIDARI et al., 2012). O presente trabalho mostra também a interação entre NtCDKG;2 e a proteína NtCBP1, uma proteína que possui um papel importante na regulação inicial da transcrição de proteínas mediadoras do crescimento do tubo polínico (LI et al., 2015). xx Adicionalmente, o screening de Y2H possibilitou a identificação da interação entre NtCDKG;2 e NtRanBP1, uma proteína chave na formação do fuso acromático que, em humanos, interage com uma isoforma homóloga a NtCDKG;2, a CDK11p46 (MIKOLAJCZYK et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011). Análises in silico realizadas com a sequência de aminoácidos de NtCDKG;2 apontaram motivos de interação com proteína do tipo F-Box, ciclina, CDK, fosfatase, 14-3-3, BRCA1 e indicaram o local provável de interação do complexo CDK-Ciclina com o respectivo inibidor. Foi testada e comprovada a interação entre NtCDKG;2 e a 14-3-3D, por Y2H, uma parceira de NtSCI1. Outra lacuna que precisava ser preenchida é referente à regulação da expressão de NtSCI1. Com este intuito, foram realizadas análises in silico para identificar elementos cis-regulatórios na sequência genômica de NtSCI1. Essas análises indicaram a presença de importantes elementos cis-regulatórios relacionados à identidade meristemática (como WUSCHEL e AINTEGUMENTA), identidade do carpelo (AGAMOUS, BELL) e progressão do ciclo celular (E2F e CDC5). Algumas considerações podem ser feitas associando os resultados obtidos a estudos feitos paralelamente em nosso laboratório: 1) Compilando a localização de NtCDKG;2 em splicing speckles e sua interação com os diferentes parceiros de interação relacionados à transcrição e splicing, sugere-se que NtCDKG;2 também atue nos processos transcricionais e de splicing. 2) Considerando a localização subcelular de NtCDKG;2 durante as diferentes fases do ciclo celular, às análises in silico dessa proteína que identificaram sua possível interação com BRCA1, além da interação confirmada com a proteína NtRanBP1, é possível sugerir que NtCDKG;2 atue, direta ou indiretamente, na organização do fuso acromático de plantas. 3) Propõem-se que NtSCI1 regule a proliferação celular no pistilo através da interação com NtCDKG;2 que se dá no nucléolo das células. Dessa forma, NtSCI1 prenderia NtCDKG;2 no nucléolo e inibiria sua atuação, como na organização do fuso acromático, o que acarretaria inibição da divisão celular. 4) Devido aos motivos cis-regulatórios encontrados na sequência genômica de NtSCI1 e o efeito que a proteína possui desde as fases iniciais do desenvolvimento do pistilo, sugere-se que a expressão desse gene seja regulada por elementos diretamente envolvidos no controle do término do meristema floral e nas vias de desenvolvimento de órgãos florais. / Studies on plant reproduction and development, specifically those related to the pistil, are of great agronomic, economic and scientific interest. In our laboratory, we recently identified and characterized SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), an inhibitor of the cell cycle which acts tissuespecifically in the pistil of Nicotiana tabacum L. and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). The NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase G; 2) protein was identified as an interaction partner of NtSCI1 (N. tabacum SCI1) in a pulldown assay (STRINI, 2014). The literature suggests that cell cycle inhibitors control the cycle through the inhibition of CDKs, indicating that NtSCI1 might control cell cycle by inhibiting NtCDKG;2. This study shows detailed analysis of GFP-NtCDKG;2 localization in leaf cells of N. benthamiana. The analysis shows that NtCDKG;2 is present in the nucleoplasm and also co-localizes with nuclear speckles. In BY2 cell culture stably expressing GFP-NtCDKG;2, it was observed that NtCDKG;2 is at the achromatic spindle during metaphase and anaphase. Additionally, BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) assays performed in this study have shown that the interaction of NtCDKG;2 and NtSCI1 occurs in the nucleolar periphery during interphase. Putative isoforms of NtCDKG;2 were also identified. The possible occurrence of these isoforms suggests that, in a similar way to its human homologue, NtCDKG;2 putative isoforms could act in different processes. To identify in which processes this protein could act, a search for NtCDKG;2 interaction partners was performed through the screening of a N. tabacum stigma and style cDNA library in the yeast two-hybrid (Y2H) system. Several partners identified through this assay have roles in RNA transcription and processing. Among the identified partners with interaction confirmed during this work, stands out the NtCDKF;1 protein, a CDK that phosphorylates the RNA polymerase II CTD, and thus, supports transcription and co-transcriptional splicing (HAJHEIDARI et al., 2012). This study also shows the interaction of NtCDKG;2 with NtCBP1, a protein which has an important role in the transcriptional regulation of genes encoding proteins mediating pollen tube growth (LI et al., 2015). Furthermore, the Y2H screening allowed the identification of the interaction of NtCDKG;2 with NtRanBP1, a key protein in the formation of the achromatic spindle which, in humans, interacts with the CDK11p46 isoform (MIKOLAJCZYK xxii et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011), a homologue of NtCDKG;2. In silico analysis of the amino acid sequence of NtCDKG;2 revealed motifs of predicted interaction with F-box proteins, cyclins, CDKs, phosphatases, 14-3-3s, BRCA1, and also pointed the region where the CDK-cyclin complex might interact with its respective inhibitor. The interaction of NtCDKG;2 with 14-3-3D, a known partner of NtSCI1, was tested and confirmed by Y2H. Another gap that needed to be filled is related to the regulation of NtSCI1 expression. To address this issue, in silico analysis to identify cis-regulatory elements was performed in NtSCI1 genomic region. These analyses revealed the presence of important cis-regulatory elements related to meristem identity (such as WUSCHEL and AINTEGUMENTA), carpel identity (AGAMOUS, BELL), and cell cycle progression (E2F and CDC5). Taken together results from this study and parallel studies performed in our laboratory, a few remarks can be made: 1) Taken the localization of NtCDKG;2 in splicing speckles, and its interaction with different proteins involved in transcription and splicing, it is suggested that NtCDKG;2 also has roles on these processes; 2) Considering the subcellular localization of NtCDKG;2 during the different cell cycle phases, the in silico analysis of this protein that predicts its interaction with BRCA1, and the confirmed interaction with NtRanBP1 protein, it is possible to suggest that NtCDKG;2 has a direct or indirect role in the organization of the achromatic spindle in plants; 3) It is proposed that NtSCI1 regulates cell proliferation in the pistil through its interaction with NtCDKG;2, which occurs in the nucleolus. Thus, NtSCI1 could hold NtCDKG;2 in the nucleolus, inhibiting its actions, such as in the organization of the achromatic spindle, resulting in cell division arrest. 4) Due to the cis-regulatory elements found in the genomic sequence of NtSCI1, and the effect of this protein since the initial stages of pistil development, it is suggested that its expression is regulated by elements directly involved in the control of the floral meristem termination and pathways of floral organ development.

Os estudos em reprodução e desenvolvimento das plantas, especialmente voltados ao pistilo, são de grande interesse agronômico, econômico e científico. Em nosso laboratório, recentemente, foi identificado e caracterizado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), um inibidor do ciclo celular que atua de forma tecido específica no pistilo de Nicotiana tabacum L. e Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). Foi identificada a proteína NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase 2) como parceira de interação de NtSCI1 (N . tabacum SCI1), em um ensaio de pull-down (STRINI, 2014). A literatura aponta que os inibidores de ciclo celular regulam o ciclo através da inibição de CDK, o que sugere que NtSCI1 possa regular o ciclo celular através da inibição de NtCDKG;2. O presente estudo mostra análises detalhadas da localização de GFP-NtCDKG;2 em células epiteliais de N. benthamiana. Verificou-se que a proteína NtCDKG;2 está presente no nucleoplasma e também co-localiza em speckles nucleares. Em cultura de células BY2 expressando GFP-NtCDKG;2 de forma estável, foi observado que, durante a metáfase e anáfase, a proteína NtCDKG;2 está junto ao fuso acromático. Adicionalmente, ensaios de BiFC (Bi-molecular Fluorescence Complementation) realizados neste trabalho mostram que a interação entre as proteínas NtCDKG;2 e NtSCI1 ocorre em uma região localizada na periferia nucleolar, durante a interfase. Também foram identificadas possíveis isoformas de NtCDKG;2. A possibilidade da ocorrência de isoformas sugere que, de maneira análoga à sua homóloga em humanos, as isoformas resultantes de NtCDKG;2 possam atuar em diferentes processos. Em busca de parceiros de interação de NtCDKG;2, para identificar em que vias esta proteína atua, foi realizado um screening de uma biblioteca de cDNAs de estigmas e estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido em leveduras (Y2H). Através desse ensaio, foram identificados diversos parceiros envolvidos com transcrição e processamento de RNA. Dentre as proteínas identificadas, cuja interação foi confirmada neste trabalho, destaca-se a proteína NtCDKF;1, uma proteína que fosforila o CTD da RNA Polimerase II e, dessa forma, auxilia a transcrição e o splicing cotranscricional (HAJHEIDARI et al., 2012). O presente trabalho mostra também a interação entre NtCDKG;2 e a proteína NtCBP1, uma proteína que possui um papel importante na regulação inicial da transcrição de proteínas mediadoras do crescimento do tubo polínico (LI et al., 2015). xx Adicionalmente, o screening de Y2H possibilitou a identificação da interação entre NtCDKG;2 e NtRanBP1, uma proteína chave na formação do fuso acromático que, em humanos, interage com uma isoforma homóloga a NtCDKG;2, a CDK11p46 (MIKOLAJCZYK et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011). Análises in silico realizadas com a sequência de aminoácidos de NtCDKG;2 apontaram motivos de interação com proteína do tipo F-Box, ciclina, CDK, fosfatase, 14-3-3, BRCA1 e indicaram o local provável de interação do complexo CDK-Ciclina com o respectivo inibidor. Foi testada e comprovada a interação entre NtCDKG;2 e a 14-3-3D, por Y2H, uma parceira de NtSCI1. Outra lacuna que precisava ser preenchida é referente à regulação da expressão de NtSCI1. Com este intuito, foram realizadas análises in silico para identificar elementos cis-regulatórios na sequência genômica de NtSCI1. Essas análises indicaram a presença de importantes elementos cis-regulatórios relacionados à identidade meristemática (como WUSCHEL e AINTEGUMENTA), identidade do carpelo (AGAMOUS, BELL) e progressão do ciclo celular (E2F e CDC5). Algumas considerações podem ser feitas associando os resultados obtidos a estudos feitos paralelamente em nosso laboratório: 1) Compilando a localização de NtCDKG;2 em splicing speckles e sua interação com os diferentes parceiros de interação relacionados à transcrição e splicing, sugere-se que NtCDKG;2 também atue nos processos transcricionais e de splicing. 2) Considerando a localização subcelular de NtCDKG;2 durante as diferentes fases do ciclo celular, às análises in silico dessa proteína que identificaram sua possível interação com BRCA1, além da interação confirmada com a proteína NtRanBP1, é possível sugerir que NtCDKG;2 atue, direta ou indiretamente, na organização do fuso acromático de plantas. 3) Propõem-se que NtSCI1 regule a proliferação celular no pistilo através da interação com NtCDKG;2 que se dá no nucléolo das células. Dessa forma, NtSCI1 prenderia NtCDKG;2 no nucléolo e inibiria sua atuação, como na organização do fuso acromático, o que acarretaria inibição da divisão celular. 4) Devido aos motivos cis-regulatórios encontrados na sequência genômica de NtSCI1 e o efeito que a proteína possui desde as fases iniciais do desenvolvimento do pistilo, sugere-se que a expressão desse gene seja regulada por elementos diretamente envolvidos no controle do término do meristema floral e nas vias de desenvolvimento de órgãos florais. / Studies on plant reproduction and development, specifically those related to the pistil, are of great agronomic, economic and scientific interest. In our laboratory, we recently identified and characterized SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), an inhibitor of the cell cycle which acts tissuespecifically in the pistil of Nicotiana tabacum L. and Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (DEPAOLI et al., 2011; DEPAOLI; DORNELAS; GOLDMAN, 2014). The NtCDKG;2 (N. tabacum Cyclin-dependent Kinase G; 2) protein was identified as an interaction partner of NtSCI1 (N. tabacum SCI1) in a pulldown assay (STRINI, 2014). The literature suggests that cell cycle inhibitors control the cycle through the inhibition of CDKs, indicating that NtSCI1 might control cell cycle by inhibiting NtCDKG;2. This study shows detailed analysis of GFP-NtCDKG;2 localization in leaf cells of N. benthamiana. The analysis shows that NtCDKG;2 is present in the nucleoplasm and also co-localizes with nuclear speckles. In BY2 cell culture stably expressing GFP-NtCDKG;2, it was observed that NtCDKG;2 is at the achromatic spindle during metaphase and anaphase. Additionally, BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation) assays performed in this study have shown that the interaction of NtCDKG;2 and NtSCI1 occurs in the nucleolar periphery during interphase. Putative isoforms of NtCDKG;2 were also identified. The possible occurrence of these isoforms suggests that, in a similar way to its human homologue, NtCDKG;2 putative isoforms could act in different processes. To identify in which processes this protein could act, a search for NtCDKG;2 interaction partners was performed through the screening of a N. tabacum stigma and style cDNA library in the yeast two-hybrid (Y2H) system. Several partners identified through this assay have roles in RNA transcription and processing. Among the identified partners with interaction confirmed during this work, stands out the NtCDKF;1 protein, a CDK that phosphorylates the RNA polymerase II CTD, and thus, supports transcription and co-transcriptional splicing (HAJHEIDARI et al., 2012). This study also shows the interaction of NtCDKG;2 with NtCBP1, a protein which has an important role in the transcriptional regulation of genes encoding proteins mediating pollen tube growth (LI et al., 2015). Furthermore, the Y2H screening allowed the identification of the interaction of NtCDKG;2 with NtRanBP1, a key protein in the formation of the achromatic spindle which, in humans, interacts with the CDK11p46 isoform (MIKOLAJCZYK xxii et al., 2003; YOKOYAMA et al., 2008; ZHANG; DAWE, 2011), a homologue of NtCDKG;2. In silico analysis of the amino acid sequence of NtCDKG;2 revealed motifs of predicted interaction with F-box proteins, cyclins, CDKs, phosphatases, 14-3-3s, BRCA1, and also pointed the region where the CDK-cyclin complex might interact with its respective inhibitor. The interaction of NtCDKG;2 with 14-3-3D, a known partner of NtSCI1, was tested and confirmed by Y2H. Another gap that needed to be filled is related to the regulation of NtSCI1 expression. To address this issue, in silico analysis to identify cis-regulatory elements was performed in NtSCI1 genomic region. These analyses revealed the presence of important cis-regulatory elements related to meristem identity (such as WUSCHEL and AINTEGUMENTA), carpel identity (AGAMOUS, BELL), and cell cycle progression (E2F and CDC5). Taken together results from this study and parallel studies performed in our laboratory, a few remarks can be made: 1) Taken the localization of NtCDKG;2 in splicing speckles, and its interaction with different proteins involved in transcription and splicing, it is suggested that NtCDKG;2 also has roles on these processes; 2) Considering the subcellular localization of NtCDKG;2 during the different cell cycle phases, the in silico analysis of this protein that predicts its interaction with BRCA1, and the confirmed interaction with NtRanBP1 protein, it is possible to suggest that NtCDKG;2 has a direct or indirect role in the organization of the achromatic spindle in plants; 3) It is proposed that NtSCI1 regulates cell proliferation in the pistil through its interaction with NtCDKG;2, which occurs in the nucleolus. Thus, NtSCI1 could hold NtCDKG;2 in the nucleolus, inhibiting its actions, such as in the organization of the achromatic spindle, resulting in cell division arrest. 4) Due to the cis-regulatory elements found in the genomic sequence of NtSCI1, and the effect of this protein since the initial stages of pistil development, it is suggested that its expression is regulated by elements directly involved in the control of the floral meristem termination and pathways of floral organ development.

A modulação da forma e tamanho em órgãos vegetais depende do controle temporal e espacial de divisão e expansão celular. Entretanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos moleculares que regulam este processo durante o desenvolvimento floral. O estudo da via de sinalização de SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) pode contribuir para o entendimento do processo de crescimento das flores. Este gene produz uma proteína, localizada no nucléolo, que está relacionada à inibição da proliferação celular no estigma e no estilete de Nicotiana tabacum, modulando o tamanho destes órgãos florais. Experimentos feitos para a identificação de parceiros de interação de SCI1 identificaram as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum como candidatas à interação. A família 14-3-3 é composta de proteínas altamente conservadas, que formam dímeros em sua conformação nativa e são responsáveis pela modulação da atividade das mais variadas proteínas em resposta a sinais intracelulares. Por isso, estas proteínas estão associadas à regulação de uma série de processos, incluindo o metabolismo, transcrição, ciclo celular, entre outros. Neste contexto, o presente trabalho teve como objetivo estudar as proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum e o seu papel durante o desenvolvimento floral. Os resultados aqui obtidos revelaram que a 14-3-3A possui localização citoplasmática e nuclear, enquanto a 14-3-3D se distribui apenas no citoplasma. Também foi evidenciado que estas proteínas são capazes de formar homodímeros e heterodímeros entre si. Os homodímeros de 14-3-3A estão distribuídos no citoplasma e no núcleo, enquanto os homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros se encontram apenas no citoplasma. Adicionalmente, a interação in vivo entre a 14-3-3A e SCI1 foi confirmada por BiFC, apresentando localização nuclear, fora do nucléolo. Análises in silico da sequência de aminoácidos de SCI1 identificaram duas regiões putativas de reconhecimento por proteínas 14-3-3s. Estas regiões estão sendo analisadas funcionalmente por meio de ensaios de BiFC com sequências mutadas de SCI1. A análise deste conjunto de resultados, juntamente com outros resultados obtidos em nosso laboratório, sugere que apenas homodímeros de 14-3-3D e heterodímeros formados entre 14-3-3A e 14-3-3D sejam capazes de interagir com SCI1. Adicionalmente, a localização nuclear dessa interação difere daquelas observadas para SCI1 e para as 14-3-3s individualmente, sugerindo que as 14-3-3s migrem para o núcleo para interagir com SCI1. Nossa hipótese é de que as proteínas 14-3-3s possam modular a localização subnuclear de SCI1. Com o objetivo de levantar dados a respeito das possíveis funções desempenhadas pelas proteínas 14-3-3A e 14-3-3D de N. tabacum, foram identificados os grupos de possíveis ortólogos dessas proteínas em A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum e N. benthamiana. Esta análise mostrou que os ortólogos às 14-3-3A e D em Arabidopsis estão associados ao ciclo celular, o que sugere que as proteínas de tabaco possam ter conservado essa função. Além disso, também foram produzidas plantas transgênicas silenciadas para cada uma dessas 14-3-3s de maneira independente. A análise dos fenótipos das plantas transgênicas não levou à elaboração de uma hipótese definitiva sobre a função dessas 14-3-3s no desenvolvimento floral. No entanto, algumas plantas transgênicas apresentaram estruturas menores, especialmente as pétalas, sugerindo que estas proteínas podem estar envolvidas no controle do tamanho de órgãos vegetais. / The modulation of size and shape in plant organs depends on temporal and spatial control of cell division and expansion. However, the molecular mechanisms that regulate this process during floral development are poorly understood. The study of SCI1 (Stigma/style Cell Cycle Inhibitor 1) signaling pathway can contribute to the understanding of the flower growing process. This gene produces a protein which is located in the nucleolus and is related to the inhibition of cell proliferation in the Nicotiana tabacum stigma and style, modulating the size of these organs. Experiments performed to identify SCI1 interaction partners have identified the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins as interaction candidates. The 14-3-3 family is composed of highly conserved proteins, which form dimers in their native conformation and are responsible to modulate the activity of a large variety of proteins in response to intracellular signals. Therefore, these proteins are associated to the regulation of several processes, including metabolism, transcription, and cell cycle, among others. In this context, the present work aimed to study the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins and their role during flower development. The results here obtained revealed that 14-3-3A is located in the nucleus and the cytosol, while 14-3-3D protein is distributed only in the cytosol. It was also shown that these proteins can form homodimers and heterodimers with each other. Homodimers of 14-3-3A are distributed in nucleus and cytosol, while 14-3-3D homodimers and heterodimers are located only in the cytosol. Furthermore, the in vivo interaction between SCI1 and 14-3-3A was confirmed by BiFC, showing nuclear localization, outside the nucleolus. In silico analyzes of SCI1 amino acid sequence identified two putative regions of recognition by 14-3-3 proteins. These regions are being evaluated by BiFC assays with SCI1 mutated sequences. The analyses of this set of results, together with other results obtained in our laboratory, suggests that only 14-3-3D homodimers and heterodimers between 14-3-3A and 14-3-3D are capable to interact with SCI1. Moreover, the nuclear localization of this interaction differs from the ones observed for SCI1 and for the 14-3-3s individually, which suggests that the 14-3-3s migrate to the nucleus to interact with SCI1. Our hypothesis is that the 14-3-3 proteins can modulate the subnuclear localization of SCI1. To obtain data concerning the possible roles of the N. tabacum 14-3-3A and 14-3-3D proteins, groups of possible orthologous of these proteins in A. thaliana, O. sativa, S. lycopersicum, S. tuberosum and N. benthamiana were identified. This analysis has shown that the orthologs of 14-3-3A and D in Arabidopsis are associated to the cell cycle, suggesting that the tobacco proteins might have conserved this function. Furthermore, transgenic plants silenced for each of the 14-3-3s independently were also produced. Phenotype analyzes of transgenic plants did not lead to a definitive hypothesis about the function of these 14-3-3s during floral development. However, some transgenic plants exhibited smaller structures, specially petals, which suggests that these proteins may be involved in the size control of plant organs.

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A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular. / The biology of plant reproduction is a field of great interest, since most of the food consumed by humans is composed of reproductive parts of plants (fruits and seeds). The pistil is the female reproductive organ, composed of stigma, style and ovary. Due to the central importance of the pistil in the success of plant reproduction, a better knowledge of the genes and processes that regulate pistil development and function is necessary. Comparative studies of gene expression in vegetative and reproductive organs of Nicotiana tabacum have revealed genes preferentially expressed in the reproductive organs, among them some encoding proteins of unknown function. One of these genes was characterized and denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), since it has an important role in stigma/style development, acting as a tissue-specific cell-cycle inhibitor (DePaoli et al., 2011). The objective of the present work was to study the molecular mechanisms through which NtSCI1 regulates the cell cycle investigating its interaction partners. In a pull-down assay, using nuclear protein extracts from N. tabacum stigmas/styles, several putative cell cycle regulators were identified. Among them, the interaction between NtSCI1 and NtCDKG;2 was confirmed by BiFC and localized in the nucleolus. A N. tabacum stigma/style cDNA library in the yeast two-hybrid system was successfully constructed. The screening of this library, using BD-NtSCI1 as bait, allowed the identification of several NtSCI1 interaction partners, among them: a DEAD-BOX RNA helicase; the 14-3-3D2 protein; two transcription factors (HOMEOBOX-22 and STOREKEEPER); a splicing factor containing a SWAP domain; an adenosine kinase; and a transposase. The interactions between NtSCI1 and the first three mentioned partners have already been confirmed by BiFC (observed in the nucleus and nucleolus) and the interaction between NtSCI1 and Nt14-3-3D2 was also wconfirmed by co-immunoprecipitation. The NtSCI1 involvement in cell cycle regulation was corroborated by the interaction between NtSCI1 and the NtCYCLIN-L1 (a regulatory subunit of CDKG;2), which was confirmed by two-hybrid and BiFC in the nucleolus. The interaction between NtSCI1 and NtCYCLIN-RELATED was also confirmed by BiFC. To understand the dynamics of NtSCI1 in the nucleolus, the subcellular localization of the fusion protein NtSCI1-GFP was studied during the different cell cycle phases. NtSCI1-GFP was observed in the nucleolus of BY-2 cells at interphase and prophase, disappearing at metaphase and anaphase and reappearing in the nucleolus at the end of telophase, showing that NtSCI1 presence in the cell is controlled by the cell cycle. The construction of the first version of NtSCI1 interactome showed its direct and indirect involvement with proteins related to RNA metabolism, transcription control and cell cycle regulation. These results suggest that NtSCI1 may act in cell cycle control in a non-canonical way, through multiple parallel processes interconnecting aspects of transcription regulation, RNA processing and cell cycle control.

A biologia da reprodução de plantas é um campo de grande interesse, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes). O pistilo é o órgão reprodutivo feminino, composto de estigma, estilete e ovário. Devido à importância central do pistilo no sucesso da reprodução de plantas, faz-se necessário um melhor conhecimento dos genes e processos que regulam seu desenvolvimento e funcionamento. Estudos comparativos da expressão gênica nos órgãos vegetativos e reprodutivos de Nicotiana tabacum revelaram genes de expressão preferencial nos órgãos reprodutivos, entre eles alguns codificando proteínas de função ainda desconhecida. Um destes genes foi caracterizado e denominado SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), por apresentar um papel importante no desenvolvimento do estigma/estilete, atuando como um inibidor de ciclo celular tecido-específico (DePaoli et al., 2011). O presente trabalho teve como objetivo estudar os mecanismos moleculares pelos quais NtSCI1 regula o ciclo celular, investigando seus parceiros de interação. Em um ensaio de pull-down, utilizando-se extrato proteico nuclear de estigmas/estiletes de N. tabacum, vários putativos reguladores de ciclo celular foram identificados, sendo a interação entre NtSCI1 e NtCDKG;2 confirmada por BiFC e localizada no nucléolo. Uma biblioteca de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum, no sistema de duplo-híbrido de levedura, foi construída com sucesso. O screening desta biblioteca, utilizando BD-NtSCI1 como \"isca\", permitiu a identificação de vários parceiros de interação com NtSCI1, entre eles: uma helicase de RNA DEAD-BOX, a proteína 14-3-3D2, dois fatores de transcrição (HOMEOBOX-22 e STOREKEEPER), um fator de splicing portador do domínio SWAP, uma quinase de adenosina e uma transposase. As interações entre NtSCI1 e os três primeiros parceiros citados já foram confirmadas por BiFC (observadas no núcleo e nucléolo) e a interação entre NtSCI1 e Nt14-3-3D2 foi confirmada também por co-imunoprecipitação. O envolvimento de NtSCI1 com a regulação do ciclo celular foi corroborado pela interação entre NtSCI1 e a proteína NtCICLINA-L1 (subunidade regulatória de CDKG;2), confirmada por duplo-híbrido e por BiFC, no nucléolo. A interação entre NtSCI1 e NtCICLINA-RELATED também foi confirmada por BiFC. Para entender a dinâmica de NtSCI1 no nucléolo, foi estudada a localização subcelular da proteína de fusão NtSCI1-GFP durante as fases do ciclo celular. NtSCI1-GFP foi observada no nucléolo de células BY-2 em interfase e prófase, desaparecendo na metáfase e anáfase e reaparecendo no nucléolo no final da telófase, mostrando que a presença de NtSCI1 na célula é controlada pelo ciclo celular. A construção de uma primeira versão do interactoma de NtSCI1 mostrou seu envolvimento direto e indireto com proteínas relacionadas ao metabolismo de RNAs, controle da transcrição e regulação do ciclo celular. Estes resultados sugerem que NtSCI1 possa atuar no controle do ciclo celular de forma não canônica, por meio de múltiplos processos paralelos que interconectam aspectos da regulação da transcrição e o processamento de RNAs com o controle do ciclo celular. / The biology of plant reproduction is a field of great interest, since most of the food consumed by humans is composed of reproductive parts of plants (fruits and seeds). The pistil is the female reproductive organ, composed of stigma, style and ovary. Due to the central importance of the pistil in the success of plant reproduction, a better knowledge of the genes and processes that regulate pistil development and function is necessary. Comparative studies of gene expression in vegetative and reproductive organs of Nicotiana tabacum have revealed genes preferentially expressed in the reproductive organs, among them some encoding proteins of unknown function. One of these genes was characterized and denominated SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), since it has an important role in stigma/style development, acting as a tissue-specific cell-cycle inhibitor (DePaoli et al., 2011). The objective of the present work was to study the molecular mechanisms through which NtSCI1 regulates the cell cycle investigating its interaction partners. In a pull-down assay, using nuclear protein extracts from N. tabacum stigmas/styles, several putative cell cycle regulators were identified. Among them, the interaction between NtSCI1 and NtCDKG;2 was confirmed by BiFC and localized in the nucleolus. A N. tabacum stigma/style cDNA library in the yeast two-hybrid system was successfully constructed. The screening of this library, using BD-NtSCI1 as bait, allowed the identification of several NtSCI1 interaction partners, among them: a DEAD-BOX RNA helicase; the 14-3-3D2 protein; two transcription factors (HOMEOBOX-22 and STOREKEEPER); a splicing factor containing a SWAP domain; an adenosine kinase; and a transposase. The interactions between NtSCI1 and the first three mentioned partners have already been confirmed by BiFC (observed in the nucleus and nucleolus) and the interaction between NtSCI1 and Nt14-3-3D2 was also wconfirmed by co-immunoprecipitation. The NtSCI1 involvement in cell cycle regulation was corroborated by the interaction between NtSCI1 and the NtCYCLIN-L1 (a regulatory subunit of CDKG;2), which was confirmed by two-hybrid and BiFC in the nucleolus. The interaction between NtSCI1 and NtCYCLIN-RELATED was also confirmed by BiFC. To understand the dynamics of NtSCI1 in the nucleolus, the subcellular localization of the fusion protein NtSCI1-GFP was studied during the different cell cycle phases. NtSCI1-GFP was observed in the nucleolus of BY-2 cells at interphase and prophase, disappearing at metaphase and anaphase and reappearing in the nucleolus at the end of telophase, showing that NtSCI1 presence in the cell is controlled by the cell cycle. The construction of the first version of NtSCI1 interactome showed its direct and indirect involvement with proteins related to RNA metabolism, transcription control and cell cycle regulation. These results suggest that NtSCI1 may act in cell cycle control in a non-canonical way, through multiple parallel processes interconnecting aspects of transcription regulation, RNA processing and cell cycle control.