A reprodução das plantas é um tópico de grande interesse para a ciência básica e para a agricultura. O pistilo, a estrutura reprodutiva feminina das angiospermas, é um órgão que desempenha papéis importantes no sucesso reprodutivo. É responsável por receber os grãos de pólen, fornecer as condições para a hidratação destes e a emissão de tubos polínicos que crescem em direção ao ovário. Adicionalmente, o pistilo produz frutos e sementes após a fecundação dos óvulos, contidos no interior do ovário. Há muito tempo se estuda o fito-hormônio auxina e muito se sabe sobre sua ação fisiológica e molecular. Contudo, embora avanços recentes sugiram uma grande influência deste hormônio no controle do desenvolvimento do pistilo, são escassos os dados na literatura sobre a influência de níveis aumentados de auxina no desenvolvimento das partes superiores do pistilo: estigma e estilete. Para preencher esta lacuna, este projeto teve como objetivos: I) produzir plantas transgênicas de Nicotiana tabacum com níveis aumentados de auxina no pistilo, através da expressão da enzima de biossíntese de auxina triptofano-monoxigenase (iaaM), de Agrobacterium tumefaciens, sob controle do promotor de N. tabacum STIG1, o qual confere expressão específica no estigma; II) analisar o fenótipo do pistilo das plantas transgênicas obtidas, comparando-as com plantas selvagens, principalmente quanto à morfologia do pistilo e aos parâmetros reprodutivos; e III) caracterizar, através de RT-PCR quantitativa, os padrões de expressão de diferentes genes putativos de resposta a auxina nos pistilos de plantas transgênicas e controle. No total, 19 plantas transgênicas estáveis foram obtidas, das quais 13 apresentaram alterações morfológicas evidentes no pistilo. Os estiletes das plantas transgênicas STIG1prom::iaaM apresentaram-se mais compridos nos estádios iniciais do desenvolvimento floral, porém mais curtos e espessos nos estádios finais. Juntos, tais fatos sugerem um modo diferencial de percepção de níveis elevados de auxina pelo pistilo ao longo de seu desenvolvimento. Na antese, observou-se nestas plantas uma diminuição da área da superfície estigmática, com concomitante redução na secreção de exudato. Adicionalmente, plantas STIG1prom::iaaM apresentaram dificuldades no processo de auto-polinização e frutos, produzidos a partir de polinização manual controlada de pistilos transgênicos, apresentaram um tamanho final reduzido, evidenciando efeitos deletérios de níveis aumentados de auxina no desenvolvimento do pistilo e/ou no processo de polinização. Medições de auxina via LQ-MS confirmaram um considerável incremento dos níveis endógenos deste hormônio nos pistilos de uma planta transgênica (STIG1prom::iaaM 4), para os três estádios do desenvolvimento analisados. Análises de expressão gênica para 9 genes putativos de resposta a auxina, por qRT-PCR, para pistilos de três plantas transgênicas de três estádios distintos do desenvolvimento floral, revelaram significativas alterações no transcriptoma do pistilo das plantas transgênicas, sugerindo uma contribuição molecular para alguns dos genes analisados no estabelecimento dos fenótipos observados. Além de fornecerem informações relevantes sobre o papel da auxina no desenvolvimento do pistilo, as plantas transgênicas STIG1prom::iaaM, obtidas neste projeto, constituem excelentes ferramentas para investigações futuras sobre os efeitos da auxina na regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional de genes expressos no pistilo. / Plant reproduction is a topic of great interest for both basic science and agriculture. The pistil, the angiosperms female reproductive structure, is an organ that plays important roles on the successful reproduction. It is responsible for receiving pollen grains, providing conditions for their hydration and the emission of pollen tubes that grow towards the ovary. In addition, the pistil produces fruits and seeds after the fecundation of the ovules, contained in the ovary. Since a very long time the phytohormone auxin is studied and much is known about its physiological and molecular modes of action. Nevertheless, even though recent advances suggest a great influence of this hormone on the control of the pistil development, there are scarce data in the literature about the influence of elevated levels of auxin on the development of the upper parts of the pistil: the stigma and style. To fill this gap, this project aimed: I) to produce transgenic Nicotiana tabacum plants with elevated auxin levels within the pistil through the expression of the auxin biosynthesis enzyme tryptophan-monoxygenase (iaaM), from Agrobacterium tumefaciens, under the control of the N tabacum STIG1 promoter, which confers stigma-specific expression; II) to analyze the pistil phenotype of the transgenic plants obtained, comparing with wild-type plants, mainly concerning the pistil morphology and reproductive parameters; and III) to characterize through quantitative RT-PCR the expression patterns of different putative auxin-responsive genes in the pistils of transgenic and control plants. A total of 19 stable transgenic plants were obtained, from which 13 presented evident morphological alterations on the pistil. The styles of the STIG1prom::iaaM transgenic plants were longer at the early floral developmental stages, but shorter and thicker at the final stages. Together, these facts suggest a differential mode of perception of elevated auxin levels by the pistil along its development. At anthesis, it was observed a decrease on the stigmatic surface area, with concomitant reduction in the exudate secretion in these plants. Additionally, STIG1prom::iaaM plants presented difficulties in the self-pollination process, and fruits produced by hand-controlled-pollination of transgenic pistils had a reduced final size, making evident the deleterious effects of elevated auxin levels on pistil development and/or on the pollination process. Auxin measurements via LC-MS confirmed a considerable increment in the endogenous levels of this hormone in the pistils of one transgenic plant (STIG1prom::iaaM 4), for the three developmental stages analyzed. Gene expression analyses for 9 putative auxin-responsive genes through qRT-PCR, in pistils from three transgenic plants of three distinct floral developmental stages, revealed significant alterations on the pistil transcriptome of the transgenic plants, suggesting a molecular contribution for some of the analyzed genes on the establishment of the observed phenotypes. Besides providing relevant information concerning the role of auxin in pistil development, the transgenic plants STIG1prom::iaaM, obtained in this project, consist excellent tools for future investigations about the effects of auxin in the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels of pistil expressed genes.

A reprodução das plantas é um tópico de grande interesse para a ciência básica e para a agricultura. O pistilo, a estrutura reprodutiva feminina das angiospermas, é um órgão que desempenha papéis importantes no sucesso reprodutivo. É responsável por receber os grãos de pólen, fornecer as condições para a hidratação destes e a emissão de tubos polínicos que crescem em direção ao ovário. Adicionalmente, o pistilo produz frutos e sementes após a fecundação dos óvulos, contidos no interior do ovário. Há muito tempo se estuda o fito-hormônio auxina e muito se sabe sobre sua ação fisiológica e molecular. Contudo, embora avanços recentes sugiram uma grande influência deste hormônio no controle do desenvolvimento do pistilo, são escassos os dados na literatura sobre a influência de níveis aumentados de auxina no desenvolvimento das partes superiores do pistilo: estigma e estilete. Para preencher esta lacuna, este projeto teve como objetivos: I) produzir plantas transgênicas de Nicotiana tabacum com níveis aumentados de auxina no pistilo, através da expressão da enzima de biossíntese de auxina triptofano-monoxigenase (iaaM), de Agrobacterium tumefaciens, sob controle do promotor de N. tabacum STIG1, o qual confere expressão específica no estigma; II) analisar o fenótipo do pistilo das plantas transgênicas obtidas, comparando-as com plantas selvagens, principalmente quanto à morfologia do pistilo e aos parâmetros reprodutivos; e III) caracterizar, através de RT-PCR quantitativa, os padrões de expressão de diferentes genes putativos de resposta a auxina nos pistilos de plantas transgênicas e controle. No total, 19 plantas transgênicas estáveis foram obtidas, das quais 13 apresentaram alterações morfológicas evidentes no pistilo. Os estiletes das plantas transgênicas STIG1prom::iaaM apresentaram-se mais compridos nos estádios iniciais do desenvolvimento floral, porém mais curtos e espessos nos estádios finais. Juntos, tais fatos sugerem um modo diferencial de percepção de níveis elevados de auxina pelo pistilo ao longo de seu desenvolvimento. Na antese, observou-se nestas plantas uma diminuição da área da superfície estigmática, com concomitante redução na secreção de exudato. Adicionalmente, plantas STIG1prom::iaaM apresentaram dificuldades no processo de auto-polinização e frutos, produzidos a partir de polinização manual controlada de pistilos transgênicos, apresentaram um tamanho final reduzido, evidenciando efeitos deletérios de níveis aumentados de auxina no desenvolvimento do pistilo e/ou no processo de polinização. Medições de auxina via LQ-MS confirmaram um considerável incremento dos níveis endógenos deste hormônio nos pistilos de uma planta transgênica (STIG1prom::iaaM 4), para os três estádios do desenvolvimento analisados. Análises de expressão gênica para 9 genes putativos de resposta a auxina, por qRT-PCR, para pistilos de três plantas transgênicas de três estádios distintos do desenvolvimento floral, revelaram significativas alterações no transcriptoma do pistilo das plantas transgênicas, sugerindo uma contribuição molecular para alguns dos genes analisados no estabelecimento dos fenótipos observados. Além de fornecerem informações relevantes sobre o papel da auxina no desenvolvimento do pistilo, as plantas transgênicas STIG1prom::iaaM, obtidas neste projeto, constituem excelentes ferramentas para investigações futuras sobre os efeitos da auxina na regulação da expressão gênica em nível transcricional e pós-transcricional de genes expressos no pistilo. / Plant reproduction is a topic of great interest for both basic science and agriculture. The pistil, the angiosperms female reproductive structure, is an organ that plays important roles on the successful reproduction. It is responsible for receiving pollen grains, providing conditions for their hydration and the emission of pollen tubes that grow towards the ovary. In addition, the pistil produces fruits and seeds after the fecundation of the ovules, contained in the ovary. Since a very long time the phytohormone auxin is studied and much is known about its physiological and molecular modes of action. Nevertheless, even though recent advances suggest a great influence of this hormone on the control of the pistil development, there are scarce data in the literature about the influence of elevated levels of auxin on the development of the upper parts of the pistil: the stigma and style. To fill this gap, this project aimed: I) to produce transgenic Nicotiana tabacum plants with elevated auxin levels within the pistil through the expression of the auxin biosynthesis enzyme tryptophan-monoxygenase (iaaM), from Agrobacterium tumefaciens, under the control of the N tabacum STIG1 promoter, which confers stigma-specific expression; II) to analyze the pistil phenotype of the transgenic plants obtained, comparing with wild-type plants, mainly concerning the pistil morphology and reproductive parameters; and III) to characterize through quantitative RT-PCR the expression patterns of different putative auxin-responsive genes in the pistils of transgenic and control plants. A total of 19 stable transgenic plants were obtained, from which 13 presented evident morphological alterations on the pistil. The styles of the STIG1prom::iaaM transgenic plants were longer at the early floral developmental stages, but shorter and thicker at the final stages. Together, these facts suggest a differential mode of perception of elevated auxin levels by the pistil along its development. At anthesis, it was observed a decrease on the stigmatic surface area, with concomitant reduction in the exudate secretion in these plants. Additionally, STIG1prom::iaaM plants presented difficulties in the self-pollination process, and fruits produced by hand-controlled-pollination of transgenic pistils had a reduced final size, making evident the deleterious effects of elevated auxin levels on pistil development and/or on the pollination process. Auxin measurements via LC-MS confirmed a considerable increment in the endogenous levels of this hormone in the pistils of one transgenic plant (STIG1prom::iaaM 4), for the three developmental stages analyzed. Gene expression analyses for 9 putative auxin-responsive genes through qRT-PCR, in pistils from three transgenic plants of three distinct floral developmental stages, revealed significant alterations on the pistil transcriptome of the transgenic plants, suggesting a molecular contribution for some of the analyzed genes on the establishment of the observed phenotypes. Besides providing relevant information concerning the role of auxin in pistil development, the transgenic plants STIG1prom::iaaM, obtained in this project, consist excellent tools for future investigations about the effects of auxin in the regulation of gene expression at the transcriptional and post-transcriptional levels of pistil expressed genes.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.

A maioria dos representantes de Urticaceae, a família da urtiga, exibe flores díclinas, muito pequenas e discretas, que variam em número de peças florais, principalmente em relação ao perianto e androceu (perda ou união de órgãos). Gineceu pseudomonômero, ou seja, iniciação de dois ou raramente três carpelos no meristema floral, mas com apenas um carpelo contendo óvulo, é descrito para a família. Outra característica interessante com registro para a família é a presença de pistilódio nas flores estaminadas. O objetivo deste trabalho é estudar comparativamente a morfologia da flor em desenvolvimento de espécies de diferentes tribos de Urticaceae, a fim de compreender: (1) as vias que levam à grande redução floral exibida pelo grupo, (2) se o desenvolvimento pode explicar a formação do gineceu com ovário unilocular, uniovulado, provavelmente pseudomonômero, e (3) a estrutura do pistilódio nas flores estaminadas e sua função na anemofilia. Para tal, foram selecionadas 10 espécies pertencentes a cinco tribos da família Urticaceae, com exceção da tribo Forsskaoleeae. Ainda, para o estudo comparativo do pistilódio foram amostradas duas espécies de Cannabaceae (Celtis iguanaea e Trema micrantha) e uma de Moraceae (Morus nigra). Botões florais e flores foram coletados de pelo menos dois indivíduos de cada espécie e processados para exames de superfície, anatômico e de vascularização em micro-CT. Em todas as espécies estudadas, com exceção da flor pistilada de Phenax sonneratii, há a iniciação de órgãos de apenas um verticilo do perianto; a variação na meria do perianto (2-5) resulta de ausência de órgãos desde o início do desenvolvimento. A diclinia decorre de ausência de estames desde o início do desenvolvimento na flor pistilada, com exceção de Pilea cadierei (aborto de estames), e de aborto do pistilo nos estádios intermediários do desenvolvimento na flor estaminada, com exceção de Cecropia pachystachya e Coussapoa microcarpa. O gineceu pseudomonômero é atestado pela iniciação de um primórdio carpelar que se divide em dois em Cecropia pachystachya, Coussapoa microcarpa, Laportea aestuans, Myriocarpa stipitata, Pourouma cecropiifolia, Urera baccifera e Urtica dioica; em Boehmeria cylindrica, Phenax sonneratii e Pilea cadierei não ocorre essa divisão do primórdio carpelar. Os estudos de vascularização revelaram que em todas as espécies apenas um traço vascular entra no gineceu, ramifica-se em dois logo na porção basal, sendo que um entra no óvulo e o outro segue para o estilete e estigma; exceção a isso ocorre em Myriocarpa stipitata e Urtica dioica, em que entram dois traços vasculares, um se ramifica em dois, sendo que um entra no óvulo e o outro segue para o estilete e estigma, e o outro segue direto para o estilete e estigma. Essa segunda condição seria o esperado para gineceu pseudomonômero. Pistilódios estão presentes nas flores estaminadas de Boehmeria cylindrica, Myriocarpa stipitata, Laportea aestuans, Urera baccifera e Urtica dioica (Urticaceae), Celtis iguanaea e Trema micrantha (Cannabaceae), e Morus nigra (Moraceae), e rudimentos carpelares nas de Phenax sonneratii e Pilea cadierei (Urticaceae);. O pistilódio, juntamente com as sépalas e os estames, formam um aparato que atua no mecanismo de liberação explosiva de pólen a ser transportado pelo vento. Este aparato é considerado aqui como uma sinorganização floral, sem que haja união verdadeira de tecidos, que deve otimizar a anemofilia, de modo que o pólen alcance distâncias maiores, evitando autopolinização e garantindo maior variabilidade genética para essas espécies / Most species of Urticaceae, the nettle family, exhibit very small and inconspicuous diclinous flowers, which vary in number of organs, mainly in relation to the perianth and androecium (loss or union of organs). Pseudomonomerous gynoecium, that is, initiation of two or rarely three carpels in the floral meristem, but with only one carpel containing ovule, is described for the family. Another noteworthy characteristic reported for the family is the presence of a pistillodium in staminate flowers. The objective of this work was to study the morphology of the developing flower of different species of Urticaceae in order to better understand: (1) the vias that lead to a great floral reduction exhibited by the group, (2) if the development may explain the formation of a pseudomonomerous gynoecium, and (3) the pistillodium structure in staminate flowers and its function in the anemophily. For this, 10 species belonging to five tribes of the family were selected, except the Forsskaoleeae tribe. In addition, flowers of two Cannabaceae species (Celtis iguanaea and Trema micrantha) and one Moraceae species (Morus nigra) were sampled. Buds and flowers were collected and prepared for examination under scanning electron microscopy and light microscopy. Vascularization was also studied by means of a micro-CT. In all studied species, except for the pistillate flower of Phenax sonneratii, organs of only one whorl of the perianth initiate; the variation in the merosity of the perianth (2-5) results from absence of organs from the beginning of development. The dicliny results of the absence of stamens from the beginning of development in pistillate flower, except for Pilea cadierei (stamen abortion), and pistil abortion occurs in the intermediate stages of development in the staminate flower, with the exception of Cecropia pachystachya and Coussapoa microcarpa. The pseudomonomerous gynoecium is characterized by the initiation of a carpel primordium that divided into two in Cecropia pachystachya, Coussapoa microcarpa, Laportea aestuans, Myriocarpa stipitata, Pourouma cecropiifolia, Urera baccifera and Urtica dioica; in Boehmeria cylindrica, Phenax sonneratii and Pilea cadierei apparently does not occur a division of the carpel primordium. Vascularization studies showed that in all species a vascular bundle enters the gynoecium, branching in two soon in the basal portion, one goes to the ovule and the other goes to the style and stigma; exceptions are Myriocarpa stipitata and Urtica dioica, in which two vascular bundles enter the pistil: one branches in two, one enters the ovule and the other goes to the style and stigma, and the other goes straight to the style and stigma. This second condition would be expected for a pseudomonomerous gynoecium. Pistillodium are present in the staminate flowers of Boehmeria cylindrica, Myriocarpa stipitata, Laportea aestuans, Urera baccifera and Urtica dioica (Urticaceae), Celtis iguanaea and Trema micrantha (Cannabaceae); and Morus nigra (Moraceae). rudimentary carpels were observed in Phenax sonneratii and Pilea cadierei (Urticaceae); The pistillodium, together with the sepals and stamens, forms an apparatus that acts on the mechanism of explosive release of pollen to be carried by the wind. This apparatus is here considered as a floral synorganization, without a true union between tissues, that should optimize the anemophily, so that the pollen can reache greater distances, avoiding selfpollination and guaranteeing greater genetic variability for these species

A maioria dos representantes de Urticaceae, a família da urtiga, exibe flores díclinas, muito pequenas e discretas, que variam em número de peças florais, principalmente em relação ao perianto e androceu (perda ou união de órgãos). Gineceu pseudomonômero, ou seja, iniciação de dois ou raramente três carpelos no meristema floral, mas com apenas um carpelo contendo óvulo, é descrito para a família. Outra característica interessante com registro para a família é a presença de pistilódio nas flores estaminadas. O objetivo deste trabalho é estudar comparativamente a morfologia da flor em desenvolvimento de espécies de diferentes tribos de Urticaceae, a fim de compreender: (1) as vias que levam à grande redução floral exibida pelo grupo, (2) se o desenvolvimento pode explicar a formação do gineceu com ovário unilocular, uniovulado, provavelmente pseudomonômero, e (3) a estrutura do pistilódio nas flores estaminadas e sua função na anemofilia. Para tal, foram selecionadas 10 espécies pertencentes a cinco tribos da família Urticaceae, com exceção da tribo Forsskaoleeae. Ainda, para o estudo comparativo do pistilódio foram amostradas duas espécies de Cannabaceae (Celtis iguanaea e Trema micrantha) e uma de Moraceae (Morus nigra). Botões florais e flores foram coletados de pelo menos dois indivíduos de cada espécie e processados para exames de superfície, anatômico e de vascularização em micro-CT. Em todas as espécies estudadas, com exceção da flor pistilada de Phenax sonneratii, há a iniciação de órgãos de apenas um verticilo do perianto; a variação na meria do perianto (2-5) resulta de ausência de órgãos desde o início do desenvolvimento. A diclinia decorre de ausência de estames desde o início do desenvolvimento na flor pistilada, com exceção de Pilea cadierei (aborto de estames), e de aborto do pistilo nos estádios intermediários do desenvolvimento na flor estaminada, com exceção de Cecropia pachystachya e Coussapoa microcarpa. O gineceu pseudomonômero é atestado pela iniciação de um primórdio carpelar que se divide em dois em Cecropia pachystachya, Coussapoa microcarpa, Laportea aestuans, Myriocarpa stipitata, Pourouma cecropiifolia, Urera baccifera e Urtica dioica; em Boehmeria cylindrica, Phenax sonneratii e Pilea cadierei não ocorre essa divisão do primórdio carpelar. Os estudos de vascularização revelaram que em todas as espécies apenas um traço vascular entra no gineceu, ramifica-se em dois logo na porção basal, sendo que um entra no óvulo e o outro segue para o estilete e estigma; exceção a isso ocorre em Myriocarpa stipitata e Urtica dioica, em que entram dois traços vasculares, um se ramifica em dois, sendo que um entra no óvulo e o outro segue para o estilete e estigma, e o outro segue direto para o estilete e estigma. Essa segunda condição seria o esperado para gineceu pseudomonômero. Pistilódios estão presentes nas flores estaminadas de Boehmeria cylindrica, Myriocarpa stipitata, Laportea aestuans, Urera baccifera e Urtica dioica (Urticaceae), Celtis iguanaea e Trema micrantha (Cannabaceae), e Morus nigra (Moraceae), e rudimentos carpelares nas de Phenax sonneratii e Pilea cadierei (Urticaceae);. O pistilódio, juntamente com as sépalas e os estames, formam um aparato que atua no mecanismo de liberação explosiva de pólen a ser transportado pelo vento. Este aparato é considerado aqui como uma sinorganização floral, sem que haja união verdadeira de tecidos, que deve otimizar a anemofilia, de modo que o pólen alcance distâncias maiores, evitando autopolinização e garantindo maior variabilidade genética para essas espécies / Most species of Urticaceae, the nettle family, exhibit very small and inconspicuous diclinous flowers, which vary in number of organs, mainly in relation to the perianth and androecium (loss or union of organs). Pseudomonomerous gynoecium, that is, initiation of two or rarely three carpels in the floral meristem, but with only one carpel containing ovule, is described for the family. Another noteworthy characteristic reported for the family is the presence of a pistillodium in staminate flowers. The objective of this work was to study the morphology of the developing flower of different species of Urticaceae in order to better understand: (1) the vias that lead to a great floral reduction exhibited by the group, (2) if the development may explain the formation of a pseudomonomerous gynoecium, and (3) the pistillodium structure in staminate flowers and its function in the anemophily. For this, 10 species belonging to five tribes of the family were selected, except the Forsskaoleeae tribe. In addition, flowers of two Cannabaceae species (Celtis iguanaea and Trema micrantha) and one Moraceae species (Morus nigra) were sampled. Buds and flowers were collected and prepared for examination under scanning electron microscopy and light microscopy. Vascularization was also studied by means of a micro-CT. In all studied species, except for the pistillate flower of Phenax sonneratii, organs of only one whorl of the perianth initiate; the variation in the merosity of the perianth (2-5) results from absence of organs from the beginning of development. The dicliny results of the absence of stamens from the beginning of development in pistillate flower, except for Pilea cadierei (stamen abortion), and pistil abortion occurs in the intermediate stages of development in the staminate flower, with the exception of Cecropia pachystachya and Coussapoa microcarpa. The pseudomonomerous gynoecium is characterized by the initiation of a carpel primordium that divided into two in Cecropia pachystachya, Coussapoa microcarpa, Laportea aestuans, Myriocarpa stipitata, Pourouma cecropiifolia, Urera baccifera and Urtica dioica; in Boehmeria cylindrica, Phenax sonneratii and Pilea cadierei apparently does not occur a division of the carpel primordium. Vascularization studies showed that in all species a vascular bundle enters the gynoecium, branching in two soon in the basal portion, one goes to the ovule and the other goes to the style and stigma; exceptions are Myriocarpa stipitata and Urtica dioica, in which two vascular bundles enter the pistil: one branches in two, one enters the ovule and the other goes to the style and stigma, and the other goes straight to the style and stigma. This second condition would be expected for a pseudomonomerous gynoecium. Pistillodium are present in the staminate flowers of Boehmeria cylindrica, Myriocarpa stipitata, Laportea aestuans, Urera baccifera and Urtica dioica (Urticaceae), Celtis iguanaea and Trema micrantha (Cannabaceae); and Morus nigra (Moraceae). rudimentary carpels were observed in Phenax sonneratii and Pilea cadierei (Urticaceae); The pistillodium, together with the sepals and stamens, forms an apparatus that acts on the mechanism of explosive release of pollen to be carried by the wind. This apparatus is here considered as a floral synorganization, without a true union between tissues, that should optimize the anemophily, so that the pollen can reache greater distances, avoiding selfpollination and guaranteeing greater genetic variability for these species

A biologia da reprodução sexual de plantas é um campo de pesquisa de grande importância, já que a maioria dos alimentos consumidos pelo homem é composta de partes reprodutivas das plantas (frutos e sementes), oriundas do desenvolvimento de partes do pistilo fertilizado. Em Nicotiana tabacum, identificou-se um gene específico de estigma/estilete, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), que atua na inibição da proliferação celular (DePaoli et al., 2011). Através de ensaios de pull-down, verificou-se a interação da proteína SCI1 com uma proteína quinase dependente de ciclina (CDK) (Strini, dados não publicados). Este trabalho visou à caracterização dessa nova CDK, ortóloga da CDKG;2 de Arabidopsis. A sequência correspondente de N. tabacum (NtCDKG;2) foi amplificada por PCR, a partir de cDNAs de estigmas/estiletes, clonada e sequenciada, o que permitiu a confirmação de sua identidade. A expressão de NtCDKG;2 foi analisada nos diferentes órgãos vegetativos e reprodutivos, por qRT-PCR, o que evidenciou um perfil de expressão ubíqua. Ao estudar o perfil de expressão desse gene nos estigmas/estiletes dos doze estádios de desenvolvimento floral de N. tabacum, observa-se que NtCDKG;2 é mais expresso nos estádios tardios do desenvolvimento em direção à antese, indicando uma função importante de sua proteína ao final do desenvolvimento do pistilo. Análises de expressão de NtCDKG;2 em estigmas/estiletes, de plantas de N. tabacum com produção aumentada do hormônio auxina no pistilo, sugerem que NtCDKG;2 é regulado transcricionalmente por esse hormônio. A expressão transiente da proteína de fusão NtCDKG;2-GFP, em folhas de N. tabacum, evidenciou a localização nuclear da proteína em estudo. Também foram geradas plantas transgênicas estáveis com superexpressão e com silenciamento por RNAi de NtCDKG;2. Apesar dos altos níveis de transcritos de NtCDKG;2 nas plantas de superexpressão e dos baixos níveis nas plantas silenciadas, não foram observadas alterações fenotípicas macroscópicas nessas plantas. Adicionalmente, obteve-se a expressão da proteína NtCDKG;2, fusionada a uma tag de histidina em sua porção N-terminal, em células de Escherichia coliBL21(DE3)CodonPlusRP. Através dos estudos realizados neste trabalho e análises conjuntas da literatura, é possível propor que NtCDKG;2 codifique uma proteína que está envolvida no controle do ciclo celular nos estigmas/estiletes de N. tabacum. / The biology of plant sexual reproduction is a research field of great importance, since most of the food consumed by humans is composed of plant reproductive parts (fruits and seeds), originated by the development of fertilized pistil parts. In Nicotiana tabacum, it was identified a stigma/style-specific gene, SCI1 (Stigma/style Cell-cycle Inhibitor 1), which acts in the inhibition of cell proliferation (DePaoli et al., 2011). Through pull down assays, the interaction of the SCI1 protein with a cyclin-dependent protein kinase (CDK) was verified (Strini, unpublished). This work aimed the characterization of this new CDK, orthologous to the Arabidopsis CDKG;2. The N. tabacum corresponding sequence (NtCDKG;2) was PCR amplified, from stigmas/styles cDNAs, cloned and sequenced, which allowed the confirmation of its identity. The NtCDKG;2 expression was analyzed in the different vegetative and reproductive organs, by qRT-PCR, evidentiating an ubiquitous expression pattern. Studying the expression pattern of this gene in stigmas/styles of the twelve stages of N. tabacum flower development, it was observed that NtCDKG;2 is more expressed at the later developmental stages towards anthesis, indicating an important function of its protein in the end of pistil development. NtCDKG;2 expression analyses in stigmas/styles of N. tabacum plants with an enhanced auxin production in the pistil suggest that NtCDKG;2 is transcriptionally regulated by this hormone. The transient expression of the fusion protein NtCDKG;2-GFP, in N. tabacum leaves, evidentiated the nuclear localization of the studied protein. Stable transgenic plants overexpressing and silencing NtCDKG;2 by RNAi were also generated. Despite the high transcript levels in the plants overexpressing NtCDKG;2 and the low transcript levels in the silencing plants, macroscopic phenotypic alterations were not observed on these plants. Additionally, the expression of the NtCDKG;2 protein, with a histidine tag fused in its N-terminal, was obtained in Escherichia coli BL21(DE3)CodonPlusRP cells. Through studies performed on this work and literature analyses, it is possible to propose that NtCDKG;2 encodes a protein that is involved in the control of cell cycle at the N. tabacum stigmas/styles.

O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.