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Modelagem molecular e imunodetecção de DNA Metiltransferases 2 de Drosofilídeos : uma abordagem evolutiva da enigmática DNMT2

Vieira, Gilberto Cavalheiro January 2015 (has links)
A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.
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Modelagem molecular e imunodetecção de DNA Metiltransferases 2 de Drosofilídeos : uma abordagem evolutiva da enigmática DNMT2

Vieira, Gilberto Cavalheiro January 2015 (has links)
A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.
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Modelagem molecular e imunodetecção de DNA Metiltransferases 2 de Drosofilídeos : uma abordagem evolutiva da enigmática DNMT2

Vieira, Gilberto Cavalheiro January 2015 (has links)
A metilação do DNA genômico é um dos principais mecanismos de regulação epigenética nos organismos. Dentre as diferentes classes de DNA MTase, as m5C-MTase são as que se distribuem amplamente de procariotos a eucariotos. Em vertebrados existem três diferentes famílias: DNMT1, DNMT2 e DNMT3a e 3b. A DNMT1 possui atividade junto ao DNA hemimetilado. As DNMT3a e 3b são responsáveis pela metilação de novo. Já a subfamília DNMT2 possui seus sítios catalíticos altamente conservados, desde procariotos até eucariotos, possuindo propriedades que permitem executar funções tanto de metilação de novo, assim como de manutenção de metilação. Além disso, as enzimas da família DNMT2 podem atuar metilando citosinas genômicas ou de tRNAs. Em mamíferos, invertebrados e plantas a DNMT2 é classificada, prioritariamente in vivo como uma tRNA MTase. Entretanto, já foi descrita atividade de DNA MTase por parte dessas enzimas, mesmo que em baixos níveis. O que se discute são as atividades preferenciais da DNMT2 e os mecanismos que modulam sua atividade, pois se reconhece que em organismos que não possuem as MTases canônicas (DNMT1 e DNMT3), mas apresentam metilação em seu genoma, é a DNMT2 que atua como MTase em ambos os substratos. Espécies de Drosophila são conhecidas como de Dnmt2-only, justamente por possuírem apenas a DNMT2 na função de metilação de citosinas. A importância de seu papel no âmbito ecológico e evolutivo nesse grupo de espécies se reflete na presença de fenômenos peculiares, como a metilação sexo-específica presente em espécies do subgrupo willistoni de Drosophila, descrito por nosso grupo de pesquisa. No presente trabalho realizou-se a modelagem das enzimas DNMT2 de D. melanogaster, D. willistoni e Mus musculus com diferentes metodologias. A partir desses modelos realizaram-se análises comparativas com as estruturas cristalográficas de DNMT2 depositadas no banco de dados PDB, com o objetivo de estabelecer as relações evolutivas e funcionais entre as diferentes enzimas. Adicionalmente, de posse de modelos de DNMT2 - de validada qualidade - de duas espécies pertencentes a diferentes grupos evolutivos de drosofilídeos, realizaram-se estudos de caracterização evolutiva e estrutural das 22 espécies que tiveram seus genomas sequenciados e depositados no bando de dados Flybase, somando-se a essas a sequência de DNMT2 de Drosophila tropicalis (subgrupo willistoni), sequenciado por nosso grupo de pesquisa. Os resultados das análises evolutivas e estruturais sugerem propriedades diferenciais entre as DNMT2 de espécies do subgrupo willistoni em relação às demais. Estes resultados indicam que mesmo em espécies que possuem relações evolutivas próximas possam ocorrer mecanismos adaptativos que estabeleçam gradações na afinidade das DNMT2 por diferentes substratos, sem que para isso ocorram drásticas mudanças na arquitetura da enzima. / The methylation of genomic DNA is a major mechanism of epigenetic regulation in organisms. Among the different classes of DNA MTase the M5C-MTase are as widely distributed in prokaryotes to eukaryotes. In vertebrates there are three different families: DNMT1, DNMT2 and DNMT3a and 3b. The DNMT1 has activity with the hemimethylated DNA. The DNMT3a and 3b are responsible for de novo methylation. While the DNMT2 subfamily has its catalytic sites highly conserved from prokaryotes to eukaryotes, having properties that allow performing functions of both de novo and maintenance methylation. Furthermore, the DNMT2 family can act methylating cytokines, tRNAs or DNA. In mammals, invertebrates and plants, DNMT2 is classified primarily in vivo as a tRNA MTase. However,DNA-MTase activity by these enzymes has been described, even at low levels. The question is the preferred activities of DNMT2 and mechanisms that modulate its activity, because in organisms that do not have the canonical DNA-MTases (DNMT1 and DNMT3), but have cytokines methylated in its genome, the DNMT2 acts as MTase on both substrates. Drosophila species are known as Dnmt2-only. The importance of DNMT2’s role in ecological and evolutionary context in this species group is reflected by presence of a peculiar phenomenon: the sex-specific methylation described by our research group, presents in willistoni subgroup of Drosophila. In this study, DNMT2 of D. melanogaster, D. willistoni and Mus musculus were modeled by different methodologies. comparative analyzes with the crystallographic DNMT2 structures deposited in the PDB database were performed from these models, in order to establish the evolutionary and functional relationships between the different enzymes. Additionally, evolutionary and structural characterization studies of the 22 species, with the validated DNMT2 models of two species belonging to different evolutionary drosophilids groups, were conducted that have had their genomes sequenced and deposited in FlyBase data pack, adding the DNMT2 sequence of Drosophila tropicalis (willistoni subgroup) sequenced by our research group. The results of evolutionary and structural analyzes suggest differences between the DNMT2 properties of subgroup willistoni species from the other drosophilids. These results indicate that even species that have close evolutionary relationships may have adaptive mechanisms that establish gradations of DNMT2 affinity for different substrates, without the need of drastic changes in enzyme architecture.
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Análise das metiltransferases do pistilo de Nicotiana tabacum: expressão heteróloga em sistema recombinante, e comparação de seqüências genômicas em N. tabacum e seus prováveis parentais, N. sylvestris e N. tomentosiformis / Analysis of the Nicotiana tabacum L. pistil methyltransferases: heterologous expression in recombinant system and comparison of genomic sequences in N. tabacum and its likely parentals, N. sylvestris and N. tomentosiformis

Avanci, Nilton Cesar 06 April 2006 (has links)
Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.
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Análise das metiltransferases do pistilo de Nicotiana tabacum: expressão heteróloga em sistema recombinante, e comparação de seqüências genômicas em N. tabacum e seus prováveis parentais, N. sylvestris e N. tomentosiformis / Analysis of the Nicotiana tabacum L. pistil methyltransferases: heterologous expression in recombinant system and comparison of genomic sequences in N. tabacum and its likely parentals, N. sylvestris and N. tomentosiformis

Nilton Cesar Avanci 06 April 2006 (has links)
Em Angiospermas, o pistilo, contido na flor, é um órgão de extrema importância na reprodução vegetal, sendo que analisar a função dos genes expressos nos tecidos especializados que o compõem, é fundamental para um melhor entendimento do processo reprodutivo vegetal. Utilizando a técnica de screening diferencial de uma biblioteca de cDNA de estigma/estilete de Nicotiana tabacum, foi identificado um clone de cDNA (PA3), com alta similaridade a metiltransferases (SAMT, BAMT, e JAMT). O gene correspondente ao cDNA (PA3) foi denominado NtPMT (Nicotiana tabacum Pistil Methyltransferase). As metiltransferases são enzimas envolvidas em processos como desenvolvimento vegetal, respostas de defesa, sinalização química, polinização, entre outros. Dois clones de cDNAs, (46B11 e 134B02), codificando proteínas com alta similaridade a metiltransferases, foram isolados de um banco de ESTs (TOBEST), e utilizados para experimentos de expressão heteróloga. Para tanto, foram construídos dois plasmídeos recombinantes, contendo uma \"tag\" de histidinas em fusão N-terminal com as regiões codificadoras das proteínas, sob controle de um promotor forte e regulável. Os vetores de expressão bacterianos foram utilizados para transformar diferentes linhagens de Escherichia coli [BL21 (DE3), BL21(DE3) Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta], de forma a analisar os níveis de expressão em diferentes temperaturas de cultivo (37°C, 30°C e 20°C) e diferentes tempos de indução (1, 2, 3, 4, 5 e 20hs). O vetor de expressão pEXP17¬46B11 foi utilizado para transformar as três linhagens de E. coli, enquanto o vetor de expressão pEXP17-134B02 foi introduzido apenas em BL21(DE3) Rosetta. Em BL21 (DE3) a proteína esperada (22,7kDa), correspondente ao clone pEXP17-46B11, foi produzida apenas em 37°C, apresentando um bom nível de expressão já nas primeiras três horas de indução. Por outro lado, as cepas BL21 (DE3)Códon Plus-RP e BL21 (DE3) Rosetta foram capazes de produzir boa quantidade da proteína recombinante, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína de fusão (22,7kDa) pôde ser observada apenas na fração celular insolúvel, na maioria das condições testadas, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Contudo, ao se utilizar 20h de indução, na temperatura de 20°C, foi possível detectar uma pequena quantidade da proteína recombinante pEXP17-46B11 na fração celular solúvel, resultado confirmado por análises de Western blot. A linhagem BL21(DE3) Rosetta também apresentou bons níveis de expressão da proteína recombinante pEXP17-134B02, em todas as condições testadas. Entretanto, a proteína, com massa esperada (13,9kDa), foi observada apenas na fração celular insolúvel, provavelmente na forma de corpos de inclusão. Apesar de a proteína pEXP17-46B11 estar insolúvel, os bons níveis de expressão obtidos tornaram possível a utilização da mesma para a produção de anticorpos policlonais. Para tanto, bandas da proteína recombinante, induzidas em BL21(DE3) Rosetta, por três horas, à 37ºC, foram cortadas do gel de poliacrilamida, e utilizadas para a imunização de camundongos. Dois fragmentos do gene NtPMT foram amplificados via PCR, a partir do DNA genômico de N. tabacum e de suas prováveis espécies parentais, Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. Após clonagem e sequenciamento, os fragmentos obtidos foram utilizados para análises comparativas de seqüências, visando um melhor entendimento da história evolutiva desse gene, nas três espécies de Nicotiana. Os resultados obtidos corroboraram com uma das hipóteses de origem evolutiva, segundo a qual, a espécie N. tabacum teria surgido a partir de um cruzamento entre um ancestral de N. sylvestris e um ancestral de N. tomentosiformis. / In Angiosperms, the pistil of the flower is an organ of extreme importance in plant reproduction and to analyze the function of the genes expressed in the specialized tissues of the pistil is very important for a better understanding of the reproductive process. Through the differential screening of a Nicotiana tabacum stigma/style cDNA library, a cDNA clone (PA3), encoding a protein with high similarity to methyltransferases (SAMT, BAMT and JAMT), has been identified. The gene corresponding to the cDNA (PA3) has been designated NtPMT (Nicotiana tabacum ? Pistil Methyltransferase). The methyltransferases are enzymes involved in processes such as: plant development, defense responses, chemical signaling, pollination, among others. Two cDNA clones (46B11 and 134B02), encoding proteins with high similarity to methyltransferases have been isolated from the TOBEST cDNA library and have been used in heterologous expression experiments. For this purpose, two recombinant plasmids have been constructed, containing a histidine tag in N-terminal fusion with the regions encoding the proteins, under the control of a strong and regulated promoter. The bacterial expression vectors were used for the transformation of different Escherichia coli strains [BL21 (DE3), BL21(DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta], in order to analyze the expression levels in different growth temperatures (37°C, 30°C and 20°C) and different induction periods (1, 2, 3, 4, 5 and 20 hours). The expression vector pEXP17¬46B11 was used to transform the three strains of E. coli, and the expression vector pEXP17-134B02 has been introduced only in BL21(DE3) Rosetta. In BL21 (DE3), the expected protein (22.7kDa), corresponding to the pEXP17-46B11 clone, has been produced only at 37°C, showing a good expression level already at the first three hours of induction. On the other hand, the strains BL21 (DE3) Codon Plus-RP and BL21 (DE3) Rosetta were capable of producing good quantity of the recombinant protein in all conditions tested. However, the fusion protein (22.7kDa) could be observed only at the insoluble cellular fraction, in the majority of conditions tested, probably as inclusion bodies. However, using 20 h of induction at the temperature of 20°C, it was possible to detect a small quantity of the pEXP17-46B11 recombinant protein in the soluble cellular fraction, a result that has been confirmed by Western blot analyzis. The strain BL21(DE3) Rosetta has also shown good expression levels of the pEXP17-134B02 recombinant protein in all conditions tested. However, the protein with the expected mass (13.9kDa) has been observed only in the insoluble cellular fraction, probably as inclusion bodies. Despite the fact the pEXP17-46B11 protein was insoluble, the good expression levels obtained made possible its use in the production of policlonal antibodies. For this purpose, bands of the recombinant protein obtained in BL21(DE3) Rosetta, induced for three hours at 37ºC, were cut from the poliacrylamide gel and used for the immunization of mouses. Two fragments of the NtPMT gene were amplified by PCR, from genomic DNA of N. tabacum and its putative parental species Nicotiana sylvestris e Nicotiana tomentosiformis. After cloning and sequencing, the obtained fragments were used for comparative sequence analysis, aiming a better understanding of the evolutionary history of this gene in the three Nicotiana species. The results corroborate the hypothesis of the N. tabacum evolutionary origin in which it was originated by the cross between an ancestral of N. sylvestris and an ancestral of N. tomentosiformis.
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Avaliação dos efeitos antineoplásicos da Zebularina em meduloblastoma / Evaluation of antineoplastic effects of Zebularine in medulloblastoma

Andrade, Augusto Faria 07 April 2016 (has links)
O meduloblastoma (MB) é um câncer do sistema nervoso central, de origem embrionária, que surge no cerebelo. É o tumor maligno cerebral mais frequente na infância e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Atualmente, o tratamento é realizado com cirurgia, quimioterapia e radioterapia e está relacionado com diversos efeitos colaterais em médio e longo prazo. Diversos fatores contribuem para o seu desenvolvimento e progressão, entre estes, alterações nas vias de sinalização, como a Sonic Hedgehog (SHH) e Wingless. As modificações nos padrões epigenéticos, como a metilação do DNA, tem também um papel central na biologia deste tumor. Tais alterações comprometem funções básicas da célula como o controle da proliferação, sobrevivência celular e apoptose. Drogas epigenéticas como os inibidores de DNA metiltransferases (DNMTs) têm demonstrado efeitos antineoplásicos e resultados promissores para terapia do câncer. A Zebularina é um inibidor de DNMTs, que consequentemente reduz a metilação do DNA, e tem se mostrado uma importante droga antitumoral, com baixa toxicidade e atividade adjuvante à quimioterapia em tumores quimio-resistentes. Diversos estudos têm descrito seus efeitos em diferentes tipos de neoplasias, entretanto, não há relatos da sua ação em MB. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar os potenciais efeitos antineoplásicos da Zebularina em quatro linhagens de MB pediátrico (DAOY, ONS-76, UW402 e UW473). Foi observado que o tratamento com a Zebularina promoveu inibição da proliferação celular e da capacidade clonogênica, aumentou o número de células apoptóticas e células na fase S do ciclo celular (p<0,05). Adicionalmente, o tratamento induziu um aumento na expressão proteica de p53, p21 e Bax e uma diminuição da ciclina A, Bcl-2 e Survivina. Além disso, quando combinada com o quimioterápico vincristina agiu de modo sinérgico; e de modo antagônico quando combinada com a cisplatina. Através de análises de expressão gênica em larga escala (plataforma Agilent de microarray), foi encontrada diferentes vias moduladas pela droga, incluindo a dos Receptores Toll-Like e o aumento dos genes SUFU e BATF2. Aqui, foi encontrado que a Zebularina pode modular a ativação da via SHH, reduzindo os níveis de SMO, de GLI1 e de um de seus alvos, o PTCH1; contudo sem alterar os níveis de SUFU. Confirmou-se que o gene BATF2 é induzido pela Zebularina e possui regiões ricamente metiladas. Além disso, a baixa expressão do gene BATF2 está associada à um pior prognóstico em MB. Todos esses dados sugerem que a Zebularina pode ser uma droga em potencial para o tratamento adjuvante do MB / Medulloblastoma (MB) is an embryonal cerebellum tumor. It is the most common brain malignancy in children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. Currently, treatment consists of surgery, chemotherapy and radiation and is associated to medium- and long-term side effects. Several factors contribute to the development and progression of MB, for instance, alterations in signaling pathways, such as Sonic Hedgehog (SHH) and Wingless. Epigenetic changes in DNA methylation patterns also play a central role in the biology of this tumor. Such changes are able to alter basic cell functions, controlling cell proliferation, survival and apoptosis. Epigenetic drugs as DNA methyltransferases (DNMTs) inhibitors have shown anticancer effects and promising results for cancer therapy. Zebularine is a low toxicity DNMTs inhibitor that induces DNA demethylation and has been reported as an important antitumor drug with adjuvant activity to chemotherapy in chemoresistant tumors. Studies have described its effects on different types of cancer, however, there are not data concerning its action in MB. Therefore, this study aimed to analyze the potential anticancer effects of Zebularine in four pediatric MB lines (UW402, UW473, ONS- 76 and DAOY). It was observed that treatment with Zebularine promoted inhibition of cell proliferation and clonogenic capacity, increased the number of apoptosis rate and cells in S phase of the cycle (p <0.05). In addition, the treatment induced an increasing in the protein expression of p53, p21 and Bax and a decreasing in cyclin A, Survivin and Bcl-2. Also, when combined with the chemotherapeutic agent vincristine acted synergistically but resulted in antagonism when combined with cisplatin. Through large-scale gene expression analysis (Agilent microarray platform), it was found different pathways modulated by Zebularine, including the Toll-Like Receptors pathway and the overexpression of SUFU and BATF2 genes. Zebularine was able to modulate SHH pathway activation, by reducing levels of SMO, GLI1 and one of its targets, PTCH1, whereas there were no changes in SUFU levels. It was confirmed that the gene BATF2 is induced by Zebularine and contains regions richly methylated. In addition, BATF2 low expression is associated with a worse prognosis in MB. All these data suggest that Zebularine may be a potential drug for the adjuvant treatment of MB
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Análise do perfil de metilação do DNA em pacientes com câncer de mama

ARAÚJO, Nara Barbosa 31 March 2015 (has links)
Submitted by Natalia de Souza Gonçalves (natalia.goncalves@ufpe.br) on 2015-05-08T14:45:19Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO MESTRADO NARA BARBOSA.pdf: 2438195 bytes, checksum: f37491db6e785b1379cc05dba0df0017 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-08T14:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) DISSERTAÇÃO MESTRADO NARA BARBOSA.pdf: 2438195 bytes, checksum: f37491db6e785b1379cc05dba0df0017 (MD5) Previous issue date: 2015-03-31 / FACEPE / O câncer de mama é o câncer mais comum e a principal causa de morte por câncer entre as mulheres, em todo o mundo. Diferentes mutações têm sido relacionadas ao câncer, mas apenas as mutações não conseguem esclarecer a heterogeneidade do câncer de mama. Desta forma, eventos epigenéticos têm sido estudados em tecido mamário cancerígeno. A metilação do DNA é a regulação epigenética mais estudada e bem compreendida, sendo catalisado pelas enzimas da família das DNA Metiltransferases; principalmente DNMT1, DNMT3A, e DNMT3B. Além disso, DNMT2 (TRDMT1), inicialmente considerada como um membro desta família foi mais tarde descrita como uma tRNA metiltransferase e, até o momento, pouco se sabe sobre a sua função. O objetivo deste estudo foi determinar o perfil de metilação do DNA em 31 pacientes com câncer de mama ductal invasivo e 04 tecidos saudáveis obtidos a partir da mama oposta. Os níveis globais de metilação foram observados por meio de um ensaio de ELISA, enquanto que os níveis de expressão das DNMTs (DNMT1, DNMT2 e DNMT3B) foram determinados por PCR em tempo real. Os níveis de expressão gênica também foram analisados para BRCA1, BRCA2, ERBB2 e ERBB4. Todos estes parâmetros foram correlacionados com os dados dos pacientes e as características intrínsecas dos tumores. Nossos resultados mostram que a metilação global em tumores de mama é significativamente menor em comparação com os tecidos saudáveis da mama (p = 0,0034). DNMT1 e DNMT3B foram mais expressos no tecido de carcinoma mamário (p = 0,0034; p = 0,0031, respectivamente), sendo o nível de DNMT3B significativamente maior (p = 0,0391) do que o nível de DNMT1. Apenas DNMT1 exibiu uma correlação com a metilação global, apesar de ser inversa. Além disso, a expressão das DNMTs apresentou uma forte correlação positiva com BRCA1 e apenas a DNMT2 mostrou estar relacionada com BRCA2. Pacientes submetidos a terapias adjuvantes apresentaram uma diminuição significativa na expressão de DNMT2 (p = 0,0013), indicando uma redução dos níveis de metilação em moléculas de tRNA. História familiar de câncer de mama foi a única variável independente que se correlacionou com os níveis de DNMT1 (p = 0,0043), sendo maior em pacientes com risco hereditário. Nossos resultados apontam para um importante papel das DNMTs no câncer de mama e mais estudos são necessários para elucidar os mecanismos subjacentes envolvidos no processo de metilação que contribuem para o desenvolvimento e progressão do câncer de mama. / Breast cancer is the most common cancer and the leading cause of cancer deaths among women worldwide. Different mutations were related to breast cancer, but only their presence cannot explain de heterogeneity of this cancer. Then, epigenetic events have been studied in breast cancer tissues. DNA methylation is the most studied and well-understood epigenetic regulation, being catalysed by DNA methyltransferases family; mainly DNMT1, DNMT3A, and DNMT3B. Besides, DNMT2 (TRDMT1), initially thought to be a member of this family, was later described as a RNA methyltransferase and so far, little is known about its function. The aim of this study was to determine the DNA methylation profile in 31 patients with Invasive Ductal Breast Cancer and 04 healthy tissues obtained from the opposite breast. Tests were performed for global methylation levels through an ELISA assay and for the expression levels of DNMTs (DNMT1, DNMT2 and DNMT3B) by real-time PCR. Gene expression was also analysed for BRCA1, BRCA2, ERBB2 and ERBB4. All these parameters were correlated with patient‘s data and intrinsic characteristics of the tumours. Our results show that global methylation in breast tumours is significant lower compared to breast healthy tissues (p= 0.0034). DNMT1 and DNMT3B (p=0.0034; p=0.0031, respectively) showed high expression in breast cancer tissue, being DNMT3B level significantly higher (p=0.0391) than DNMT1 level. Only DNMT1 exhibit a correlation with the global methylation, despite inversely related. In addition, DNMTs presented a tightly positive correlation with BRCA1 and only DNMT2 seems to be related with BRCA2. Patients submitted to adjuvant therapies showed a significant decrease in DNMT2 expression (p=0.0013), indicating reduced methylation levels in tRNA molecules. Family history of breast cancer was the only independent variable that correlated to DNMT1 level (p=0.0043), being higher in patients with hereditary risk. Our results points to an important role of DNMTs in breast cancer and further studies are necessary to elucidate the underlying mechanisms involved in methylation process, contributing to breast cancer development and progression.
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Avaliação dos efeitos antineoplásicos da Zebularina em meduloblastoma / Evaluation of antineoplastic effects of Zebularine in medulloblastoma

Augusto Faria Andrade 07 April 2016 (has links)
O meduloblastoma (MB) é um câncer do sistema nervoso central, de origem embrionária, que surge no cerebelo. É o tumor maligno cerebral mais frequente na infância e corresponde a aproximadamente 20% de todos os tumores intracranianos pediátricos. Atualmente, o tratamento é realizado com cirurgia, quimioterapia e radioterapia e está relacionado com diversos efeitos colaterais em médio e longo prazo. Diversos fatores contribuem para o seu desenvolvimento e progressão, entre estes, alterações nas vias de sinalização, como a Sonic Hedgehog (SHH) e Wingless. As modificações nos padrões epigenéticos, como a metilação do DNA, tem também um papel central na biologia deste tumor. Tais alterações comprometem funções básicas da célula como o controle da proliferação, sobrevivência celular e apoptose. Drogas epigenéticas como os inibidores de DNA metiltransferases (DNMTs) têm demonstrado efeitos antineoplásicos e resultados promissores para terapia do câncer. A Zebularina é um inibidor de DNMTs, que consequentemente reduz a metilação do DNA, e tem se mostrado uma importante droga antitumoral, com baixa toxicidade e atividade adjuvante à quimioterapia em tumores quimio-resistentes. Diversos estudos têm descrito seus efeitos em diferentes tipos de neoplasias, entretanto, não há relatos da sua ação em MB. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar os potenciais efeitos antineoplásicos da Zebularina em quatro linhagens de MB pediátrico (DAOY, ONS-76, UW402 e UW473). Foi observado que o tratamento com a Zebularina promoveu inibição da proliferação celular e da capacidade clonogênica, aumentou o número de células apoptóticas e células na fase S do ciclo celular (p<0,05). Adicionalmente, o tratamento induziu um aumento na expressão proteica de p53, p21 e Bax e uma diminuição da ciclina A, Bcl-2 e Survivina. Além disso, quando combinada com o quimioterápico vincristina agiu de modo sinérgico; e de modo antagônico quando combinada com a cisplatina. Através de análises de expressão gênica em larga escala (plataforma Agilent de microarray), foi encontrada diferentes vias moduladas pela droga, incluindo a dos Receptores Toll-Like e o aumento dos genes SUFU e BATF2. Aqui, foi encontrado que a Zebularina pode modular a ativação da via SHH, reduzindo os níveis de SMO, de GLI1 e de um de seus alvos, o PTCH1; contudo sem alterar os níveis de SUFU. Confirmou-se que o gene BATF2 é induzido pela Zebularina e possui regiões ricamente metiladas. Além disso, a baixa expressão do gene BATF2 está associada à um pior prognóstico em MB. Todos esses dados sugerem que a Zebularina pode ser uma droga em potencial para o tratamento adjuvante do MB / Medulloblastoma (MB) is an embryonal cerebellum tumor. It is the most common brain malignancy in children and accounts for approximately 20% of all pediatric intracranial tumors. Currently, treatment consists of surgery, chemotherapy and radiation and is associated to medium- and long-term side effects. Several factors contribute to the development and progression of MB, for instance, alterations in signaling pathways, such as Sonic Hedgehog (SHH) and Wingless. Epigenetic changes in DNA methylation patterns also play a central role in the biology of this tumor. Such changes are able to alter basic cell functions, controlling cell proliferation, survival and apoptosis. Epigenetic drugs as DNA methyltransferases (DNMTs) inhibitors have shown anticancer effects and promising results for cancer therapy. Zebularine is a low toxicity DNMTs inhibitor that induces DNA demethylation and has been reported as an important antitumor drug with adjuvant activity to chemotherapy in chemoresistant tumors. Studies have described its effects on different types of cancer, however, there are not data concerning its action in MB. Therefore, this study aimed to analyze the potential anticancer effects of Zebularine in four pediatric MB lines (UW402, UW473, ONS- 76 and DAOY). It was observed that treatment with Zebularine promoted inhibition of cell proliferation and clonogenic capacity, increased the number of apoptosis rate and cells in S phase of the cycle (p <0.05). In addition, the treatment induced an increasing in the protein expression of p53, p21 and Bax and a decreasing in cyclin A, Survivin and Bcl-2. Also, when combined with the chemotherapeutic agent vincristine acted synergistically but resulted in antagonism when combined with cisplatin. Through large-scale gene expression analysis (Agilent microarray platform), it was found different pathways modulated by Zebularine, including the Toll-Like Receptors pathway and the overexpression of SUFU and BATF2 genes. Zebularine was able to modulate SHH pathway activation, by reducing levels of SMO, GLI1 and one of its targets, PTCH1, whereas there were no changes in SUFU levels. It was confirmed that the gene BATF2 is induced by Zebularine and contains regions richly methylated. In addition, BATF2 low expression is associated with a worse prognosis in MB. All these data suggest that Zebularine may be a potential drug for the adjuvant treatment of MB
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Efeito da infecção e da terapia de erradicação da Helicobacter pylori na expressão gênica de paciente com gastrite crônica / Effect of Helicobacter pylori infection and eradication therapy on gene expression of patients with chronic gastrits

Poltronieri-Oliveira, Ayla Blanco [UNESP] 04 March 2016 (has links)
Submitted by Ayla Blanco Poltronieri null (aylinha_bp@hotmail.com) on 2016-03-11T02:05:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Pós Defesa.pdf: 1526886 bytes, checksum: b50424a42154b92cbde06c084bf0975d (MD5) / Approved for entry into archive by Sandra Manzano de Almeida (smanzano@marilia.unesp.br) on 2016-03-14T12:33:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 poltronierioliveira_ab_me_sjrp.pdf: 1526886 bytes, checksum: b50424a42154b92cbde06c084bf0975d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-14T12:33:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 poltronierioliveira_ab_me_sjrp.pdf: 1526886 bytes, checksum: b50424a42154b92cbde06c084bf0975d (MD5) Previous issue date: 2016-03-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Introdução: A inflamação crônica desencadeada pela bactéria Helicobacter pylori (H. pylori), a qual é considerada o principal fator ambiental relacionado ao câncer gástrico, está associada ao desenvolvimento e progressão de lesões gástricas pré-cancerosas, desencadeando diversas modificações histológicas e moleculares que promovem a transformação maligna do estômago. Para isso, conta com fatores de virulência que promovem alterações superficiais e em vias de sinalização das células epiteliais gástricas. Consequentemente pode levar a alterações no padrão de expressão de genes supressores tumorais e da atividade de enzimas DNA metil transferases (DNMTs), responsáveis pela metilação do DNA e silenciamento gênico. Objetivos: O presente estudo avaliou se a infecção pela bactéria H. pylori, bem como sua erradicação, altera a expressão do RNAm dos genes supressores SOCS1, RPRM, RUNX3 e dos genes de DNMTs (DNMT1, DNMT3A e DNMT3B) em pacientes com gastrite crônica infectados (Hp+) em comparação com indivíduos com gastrite crônica sem infecção (Hp-). Além disso, investigou a ocorrência de correlação negativa entre a expressão do RNAm dos genes supressores tumorais com a dos genes das DNMTs, assim como a associação dos níveis de expressão gênica em relação aos fatores de risco idade, sexo, tabagismo, etilismo e genótipo bacteriano cagA. Material e Métodos: A quantificação relativa (RQ) do RNAm foi realizada por PCR (polymerase chain reaction) quantitativa em tempo real (qPCR) utilizando ensaios TaqMan® em 9 pacientes com gastrite crônica Hp- e 19 Hp+, sendo estes também avaliados três meses depois da terapia de erradicação bacteriana. O diagnóstico molecular e genotipagem do fator de virulência cagA foram realizados por PCR convencional. Resultados: Os resultados mostraram que a infecção pela H. pylori e sua erradicação não alteraram significantemente a expressão dos genes SOCS1, RPRM, RUNX3 e DNMTs, as quais apresentaram, de modo geral, expressão reduzida (RQ< 1,0), enquanto foi observado expressão mais elevada de SOCS1 e RPRM no grupo sem infecção Hp-. Quanto aos fatores de risco, também não foram encontradas associações significantes com os níveis de expressão dos genes avaliados. A análise de correlação não mostrou correlação negativa da expressão gênica entre os supressores tumorais e as DNMTs, mas evidenciou algumas correlações positivas entre a expressão dos genes SOCS1 e DNMT1 e do RPRM com DNMT3A e DNMT3B no grupo Hp+, que podem ter sido casuais. Conclusão: Nossos resultados não indicam que a infecção causada pela bactéria H. pylori e sua erradicação em pacientes com gastrite crônica afetam a expressão dos supressores tumorais SOCS1, RPRM, RUNX3 e das DNMTs, assim como que seja influenciada pelos fatores idade, sexo, tabagismo, etilismo e genótipo bacteriano cagA. Além disso, a expressão reduzida das DNMTs e ausência de correlação negativa com a dos genes supressores tumorais não permite indicar que a baixa expressão dos genes supressores tumorais seja devido a hipermetilação do DNA em consequência da infecção. / Introduction: Chronic inflammation caused by Helicobacter pylori (H. pylori), which is considered the main environmental factor related to gastric cancer, is associated with the development and progression of precancerous gastric lesions, triggering several histological and molecular changes that promote stomach malignant transformation. For this, it has virulence factors promoting superficial and signaling pathways of gastric epithelial cells changes. Consequently, it can lead to alterations in the expression of tumor suppressor genes and DNA enzyme activity methyl transferases (DNMTs), responsible for DNA methylation and gene silencing. Objectives: This study evaluated whether the infection by the bacterium H. pylori and its eradication change the mRNA expression of suppressor genes SOCS1, RPRM, RUNX3 and DNMTs (DNMT1, DNMT3A and DNMT3B) genes in patients with chronic gastritis infected (Hp+) compared to individuals with chronic gastritis without infection (Hp-). In addition, we investigated the occurrence of negative correlation between mRNA expression of tumor suppressor genes with the ones of DNMTs, as well as the association of gene expression levels in relation to the risk factors age, sex, smoking, drinking and bacterial genotype cagA. Methods: The relative quantification (RQ) mRNA was performed by PCR (polymerase chain reaction) quantitative real-time (qPCR) using TaqMan® assays in 9 patients with chronic gastritis Hp- and 19 Hp+, which are also evaluated three months after bacterial eradication therapy. The molecular diagnostics and genotyping of the virulence factors CagA were performed by standard PCR. Results: The results showed that the infection by H. pylori and eradication did not significantly alter the gene expression of SOCS1, RPRM, RUNX3 and DNMTs, which presented, in general, reduced expression (RQ <1.0); on the other hand, higher expression of SOCS1 and RPRM was observed in the group without Hp- infection. As for risk factors, no significant associations with the expression levels of evaluated genes were found. The correlation analysis not showed a negative correlation of gene expression in the tumor suppressor and DNMTs, but showed some positive correlations between the expression of SOCS1 and DNMT1 genes and RPRM with DNMT3A and DNMT3B the Hp + group, which may have been casual. Conclusion: Our findings do not indicate that the infection caused by the bacterium Helicobacter pylori and its eradication in patients with chronic gastritis affect the expression of tumor suppressor SOCS1, RPRM, RUNX3 and DNMTs, as it is influenced by factors such as age, sex, smoking, alcoholism and bacterial genotype cagA. Furthermore, the reduced expression of DNMTs and no negative correlation with the tumor suppressor genes do not indicate that the low expression of tumor suppressor genes is due to DNA hypermethylation in consequence of infection. / CNPq: 474.776/2013-1 / FAPESP: 2012/15036-8

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