Aspergillus fumigatus ist die häufigste Ursache für Lungeninfektionen in immunsuppri-mierten Patienten. Virulenzfaktoren sind häufig an Kontrollmechanismen für Entwick-lung gekoppelt, welche im verwandten Modellorganismus Aspergillus nidulans entdeckt wurden. Diese Arbeit präsentiert die Charakterisierung des F-box Proteins Fbx15 in A. fumigatus, welches einen starken Einfluss auf die Entwicklung in A. nidulans hat. Die Deletion von fbx15 resultierte in starken Wachstumsdefekten unter vielen Stress induzie-renden Bedingungen, welche klassische Virulenz Faktoren beinhalten, wie erhöhte Tem-peratur, oxidativer Stress und Aminosäuremangel, während das Wachstum unter Stan-dardbedingungen nicht beeinflusst war. Oxidativer Stress induziert eine transiente Erhöhung der fbx15 Expression, welche nach 40 Minuten zu einer dreifach erhöhten Pro-teinmenge führte. Fbx15 ist ein stabiles F-box Protein mit einer Halbwertszeit von 90 Minuten. Generell funktionieren F-box Proteine als Substratadapter für SCF-E3-Ubiquitin-Ligasen. Fbx15 liegt unter normalen Bedingungen phosphoryliert vor und in-teragiert mit der Skp1/A Untereinheit des SCF-Komplexes, vorzugsweise in kleineren Subpopulationen im Zytoplasma. Phosphoryliertes Fbx15 wird bevorzugt in SCF-Komplexe eingebaut. Oxidativer Stress führt zu einer schnellen Dephosphorylierung von Fbx15. Fbx15 Varianten, welche nicht phosphoryliert werden können, interagieren mit Skp1/A primär im Kern. Fbx15 rekrutiert drei Untereinheiten des COP9-Signalosoms und Proteine welche in Transkription, Translation, Signalübertragung, Morphologie oder Stoffwechsel involviert sind. Fbx15 bindet die Ssn6/F Untereinheit des konservierten Ssn6/SsnF-Tup1/RcoA Co-Repressors und wird für dessen Kernlokalisation benötigt. Dephosphoryliertes Fbx15 interagiert mit Ssn6/F im Kern und eine Fbx15-Ssn6/F be-dingte Genrepression wird für die Reduzierung der Gliotoxin-Biosynthese benötigt. fbx15 Deletionsstämme sind nicht in der Lage immunsupprimierte Mäuse in einem Model für invasive Aspergillose zu infizieren, was eine essentielle Funktion von Fbx15 für die Viru-lenz bestätigt. Diese Arbeit zeigt, dass Fbx15 nicht nur Teil von SCF-E3-Ubiquitin-Ligasen sein kann, sondern eine zweite neue molekulare Funktion aufweist, welche die physische Interaktion mit der Co-Repressor Untereinheit Ssn6/F und dessen Lokalisa-tionskontrolle beinhaltet. Diese duale Funktion resultiert in einer essentiellen Funktion von Fbx15 für die Kontrolle der oxidativen Stressantwort, des Sekundärmetabolismus und der Virulenz im opportunistischen Humanpathogen A. fumigatus.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.

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O desenvolvimento dos órgãos vegetativos e florais das angiospermas depende da ação combinada e finamente regulada de eventos de proliferação e expansão celular. Estudar os genes envolvidos com a regulação destes processos permite ampliar nossa compreensão sobre o desenvolvimento da flor, de seus diferentes órgãos, do processo reprodutivo como um todo, além de permitir produzir modificações de interesse econômico. Um gene codificando uma proteína da família F-box foi identificado na biblioteca TOBEST de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). A maioria das proteínas F-box pertence ao complexo SCF (formado principalmente pelas proteínas SKP1, CUL1 e F-box), participando da marcação de proteínas alvo para a degradação pela via ubiquitina-proteassomo. O gene identificado no TOBEST demonstrou expressão preferencial nos órgãos florais e foi denominado FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Plantas de silenciamento e superexpressão deste gene indicaram alterações no tamanho dos órgãos florais, incluindo o pistilo, foco principal de estudo em nosso laboratório (Abbad, 2012). O screening de duplo-híbrido de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete de N. tabacum identificou a interação com uma SKP1, indicando que a FEF1 poderia atuar junto ao complexo SCF (Abbad, 2012). No presente trabalho foram realizadas análises macroscópicas e microscópicas em pistilos de plantas transgênicas da geração T1, que permitiram: 1) verificar a estabilidade dos transgenes e das alterações fenotípicas na descendência; 2) quantificar e analisar estatisticamente as alterações de tamanho do pistilo; e 3) verificar as alterações em nível celular, que resultaram nas alterações do tamanho do pistilo, ocorridas nas plantas transgênicas. As plantas de silenciamento apresentaram redução estatisticamente significativa do comprimento de pistilos e da largura dos ovários. As análises histológicas permitiram verificar que ocorreu a redução da proliferação celular na zona secretória do estigma e no parênquima do ovário destas plantas. Por outro lado, as plantas de superexpressão demonstraram aumento estatisticamente significativo do comprimento dos pistilos e da largura de estigmas e ovários. Nestas plantas, foi verificado o aumento do número de células na zona secretória do estigma e parênquima do ovário. A interação entre FEF1 e a SKP1 foi confirmada em experimento de BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), corroborando a participação dessa F-box no complexo SCF. A interação entre estas proteínas ocorre no citoplasma das células vegetais, indicando que este é o local de atuação de FEF1. A participação no complexo SCF confere a essa F-box o papel de seleção dos alvos a serem poliubiquitinados pelo complexo. A análise de candidatos do screening revelou três novos parceiros de interação de FEF1, todos fatores de transcrição da classe I da família TCP, relacionados com a regulação da proliferação celular. Estas proteínas são candidatas à degradação no proteassomo, sinalizada pela marcação promovida pelo complexo SCFFEF1. Deste modo, propomos que a FEF1 desempenhe uma função na regulação do desenvolvimento e do tamanho final dos órgãos florais, mais especificamente do pistilo, através da regulação dos níveis de fatores de transcrição, como as TCPs aqui encontradas, envolvidas com o controle da proliferação celular. / Angiosperms vegetative and flowering organs development depends on a combined influence of finely regulated events of cell proliferation and expansion. The study of genes involved with the regulation of this processes allows the expansion of our knowledge about the flower and its organs development, of the reproductive process and allows the production of modifications of economic interest. One gene coding for an F-box family protein was identified in the TOBEST stigma/style cDNA library of N. tabacum (Quiapim et al., 2009; Abbad, 2012). The majority of F-box proteins belong to the SCF (mainly composed of the SKP1, CUL1 and F-box proteins) complex, participating in the signalization of target proteins for degradation through the ubiquitin-proteasome pathway. The gene identified on TOBEST presented preferential expression on the floral organs and was named FEF1 (Flower Expressed F-box 1). Transgenic plants silencing and overexpressing this gene indicated alteration of the floral organs, including the pistil, the main focus of study in our laboratory (Abbad, 2012). A yeast two-hybrid screening of a N. tabacum stigma/style cDNA library revealed the interaction with a SKP1 protein, indicating that FEF1 possibly functions with the SCF complex (Abbad, 2012). In the present work macroscopic and microscopic analysis of the pistils of T1 generation of transgenic plants were performed, which allowed us to: 1) Confirm the transgene and phenotypic stability through generations; 2) Quantify and statistically analyze the size alterations on the pistils; 3) Analyze the cellular modifications that produced the pistils size alterations observed in the transgenic plants. The plants silencing FEF1 presented a statistically significant reduction of the pistil length and ovary width. Histological analysis allowed the observation that a reduction in cell proliferation occurred in the secretory zone of the stigma and in the ovary parenchyma. On the other hand, overexpression plants presented statistically significant enlargement of pistil length and of stigma and ovary width. In these plants it was observed an increase in cell number in the stigma secretory zone and ovary parenchyma. The interaction between FEF1 and SKP1 was confirmed on a BiFC (Bimolecular Fluorescence Complementation), reinforcing the participation of this F-box protein in the SCF complex. The interaction between these proteins was observed to occur in the cytoplasm of plant cells, indicating that this is the cellular compartment of FEF1 action. The participation in the SCF complex confers this F-box the role of selecting targets for polyubiquitination by the complex. The analysis of candidates of the screening revealed three new interaction partners of FEF1, all of them transcription factors of the class I TCP family, related to the regulation of cell proliferation. These proteins are candidates for degradation by the proteasome, signalized by the polyubiquitination promoted by the SCFFEF1 complex. We propose that FEF1 has a role in the regulation of the development and final size of the floral organs, particularly the pistil, by regulation the levels of transcription factors like the TCPs here revealed, involved with the control of cell proliferation.

Das Ubiquitin-Proteasom-System eukaryotischer Zellen spielt eine zentrale Rolle beim Abbau von fehlgefalteten und nicht mehr benötigten Proteinen. Damit erfüllt es regulatorische Funktionen bei zellulären Prozessen wie z.B. dem Zellzyklus und der Transkription. Das Protein Proteasominhibitor 31 (PI31) wurde als Inhibitor des Proteasoms in vitro charakterisiert. Des weiteren wurde gezeigt, daß überexprimiertes PI31 im murinen System ein Modulator der Assemblierung des Immunoproteasoms (i20S) ist. Über die Funktion und Regulation von PI31 im humanen System war bisher nichts bekannt und wurde deshalb in dieser Arbeit untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß neben dem PI31-Transkript mindestens neun weitere alternative Spleißvarianten des humanen PI31 Gens PSMF1 existieren. Die PI31-Isoformen V2 bis V10 unterscheiden sich von PI31 (V1) teils durch eine fehlende N-terminale Domäne oder einen veränderten C-Terminus. Die Isoform V5 wird als einzige gewebespezifisch in Testikeln exprimiert und ist im Zellkern lokalisiert. Ausschließlich die Überexpression der Isoform V3 führt zur Inhibition der proteasomalen Aktivität in vivo. Ein modulatorischer Einfluß von PI31 oder einer der Isoformen auf die Assemblierung des humanen i20S bestätigte sich dagegen nicht. Die Überexpression von PI31 und V3 in humanen Zellen führte indes zu einer Akkumulation und verzögerten Degradation von proteasomalen Substraten. Es wurde außerdem gezeigt, daß die Expression von humanem PI31 durch virusassoziierte Stimuli wie dsRNA und Typ I-Interferone induziert werden kann. Für die 3kb lange 3’UTR der PI31-mRNA konnte zusätzlich nachgewiesen werden, daß sie inhibitorisch auf die Expression wirkt und somit eine regulatorische Funktion besitzt. In Zusammenhang mit der von Kirk et al. (2008) gezeigten Heterodimerisierung von PI31 mit dem F-Box Protein Fbxo7, weisen die hier vorgestellten Ergebnisse auf eine Funktion von PI31 und dessen Isoformen bei der Ubiquitinierung von proteasomalen Substraten hin. / The ubiquitin–proteasome pathway is the major intracellular system for protein degradation. It plays an important role in the regulation of cellular processes like cell cycle control, signal transduction and gene transcription. The protein proteasome inhibitor 31 (PI31) was initially characterized as a potent inhibitor of proteasomal activity in vitro. Furthermore it was shown that PI31 modulates the assembly of the murine immunoproteasome (i20S). The function and regulation of PI31 in the human system is so far unexplored and therefore the topic of this study. It was shown that at least nine alternatively spliced variants of the PI31 gene PSMF1 exist additionally to the PI31 transcript. The PI31 isoforms V2 to V10 differ from PI31 (V1) in parts of the N-terminus and in a modified C-terminus. Only the isoform V5 is tissue specific expressed in testis and localized in the nucleus. After overexpression only the isoform V3 has the ability to inhibit the proteasomal activity in vivo. In contrast to the murine system neither PI31 nor the isoforms showed a modulatory effect on the assembly of the i20S. The overexpression of PI31 and V3 in human cells results instead in the accumulation and delayed degradation of proteasomal substrates. Furthermore the expression of human PI31 can be induced by virus associated stimuli like dsRNA and type I interferones. In addition, for the 3kb long 3’UTR of the PI31-mRNA an inhibitory effect on the expression and therefore a regulatory role was shown. Together with data from Kirk et al. (2008), who show the heterodimerization of PI31 with the F-box protein Fbxo7, the presented results suggest a function of PI31 and its isoforms in the process of ubiquitination of proteasomal substrates.

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.

O estudo da reprodução sexual de plantas e uma área de crescente interesse devido a importância de sementes e frutos em nossa dieta diária, ambos resultantes do desenvolvimento de partes do pistilo, apos fertilização. O objetivo deste trabalho foi caracterizar um novo gene F-box expresso no pistilo de N. tabacum. Proteínas F-box atuam na interação proteína-proteína, geralmente direcionando proteínas alvo para degradação pela via ubiquitina-proteassomo. Foram identificados cinco genes de função desconhecida que codificam putativas proteínas F-box, em duas bibliotecas de cDNAs de estigmas/estiletes de N. tabacum (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009) previamente construídas em nosso laboratório. A expressão de cada um destes genes foi analisada nos diferentes órgãos de N. tabacum, por qRT-PCR. O clone 085H05 da biblioteca TOBEST (QUIAPIM et al., 2009) apresentou expressão preferencial nos órgãos florais. Este clone foi selecionado para uma caracterização funcional mais detalhada. O padrão de expressão deste gene foi avaliado no estigma/estilete durante os 12 estádios do desenvolvimento floral de N. tabacum (KOLTUNOW et al., 1990). O resultado revelou que sua expressão e regulada durante o desenvolvimento, atingindo o maior nível de expressão na antese (estádio 12). Isto sugere que este gene esteja envolvido no desenvolvimento do estigma/estilete. A sequência codificadora do gene correspondente a 085H05 foi determinada e, apos amplificação e clonagem, este gene foi denominado S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). Para compreender a função da proteína de S/S_F-box, plantas transgênicas de superexpressao e de silenciamento (por RNAi) deste gene foram geradas. As plantas de RNAi apresentaram o estilete e o ovário reduzidos quando comparados ao controle SR1. Em concordância, as plantas de superexpressao produziram flores com o estilete mais alongado do que o controle, alem do estigma e do ovário de maior tamanho. Altas concentrações de exudato foram observadas na superfície do estigma destas plantas, a partir do estádio 7 tardio. No controle SR1, concentrações equivalentes apenas são observadas nos estádios finais do desenvolvimento. Os fenótipos observados nas plantas transgênicas sugerem que a proteína codificada por S/S_F-box esteja envolvida com o desenvolvimento do pistilo e com o controle do tamanho deste órgão. Adicionalmente, as plantas de RNAi apresentaram o fenótipo de perda da dominância apical. Os níveis de expressão do gene S/S_F-box foram avaliados em plantas que tiveram aumento na produção de auxina no estigma/estilete (plantas STIG1prom::iaaM), revelando que este gene não e regulado, a nível transcricional, por este hormônio. Experimentos de localização subcelular, realizados por expressão transitória da sequência de S/S_F-box fusionada a sequência dos genes repórteres GFP e YFP (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), indicaram que a proteína S/S_F-box esta localizada no citoplasma e no núcleo celular. Adicionalmente, foi realizado o screening de uma biblioteca de cDNAs de estigma/estilete, construída no sistema de duplo-hibrido, para investigar proteínas candidatas a interagirem com a proteína de S/S_F-box. Os resultados indicaram interação da proteína S/S_F-box com SKP1, confirmando a participação de S/S_F-box no complexo SCF, que promove a degradação de proteínas alvo pela via ubiquitina-proteassomo. Duas proteínas candidatas a alvo foram identificadas: os fatores de transcrição VOZ1 e SIP1, ambos envolvidos com a proliferação celular. Em suma, e possível propor que a proteína codificada por S/S_F-box tenha função relacionada a proliferação celular e ao desenvolvimento dos órgãos vegetais, incluindo o pistilo. / The study of sexual reproduction in plants is an area of increasing interest due to the importance of seeds and fruits in our daily diet, both resulting from the development of parts of the pistil, after fertilization. The aim of this study was to characterize a new F-box gene expressed in the N. tabacum pistil. F-box proteins act in protein-protein interactions, generally directing target proteins to degradation via ubiquitin-proteasome. Five genes of unknown function coding for putative F-box proteins were identified at two cDNAs libraries from N. tabacum stigmas/styles (DEPAOLI, 2006; QUIAPIM et al., 2009), previously constructed in our laboratory. The expression of each of these genes was analyzed in the different N. tabacum organs, by qRT-PCR. The 085H05 clone from the TOBEST library (QUIAPIM et al., 2009) showed preferential expression in floral organs. This clone was select for a more detailed functional characterization. The expression pattern of this gene was evaluated in the stigma/style during the 12 N. tabacum flower developmental stages (KOLTUNOW et al., 1990). The result revealed that its expression is regulated during development, reaching the highest expression level at anthesis (stage 12). It suggests that this gene is involved in the stigma/style development. The coding sequence of the gene corresponding to 085H05 was determined and, after amplification and cloning, the gene was named S/S_F-box (Stigma/Style_F-box). To understand the S/S_F-box protein function, transgenic plants either overexpressing or silencing (by RNAi) the S/S_F-box gene were generated. The RNAi plants showed reduced style and ovary when compared to the control SR1. In accordance, the overexpressing plants produced flowers with a style more elongated than the control, besides an ovary and a stigma of larger size. High concentrations of exudate were observed on the stigma surface of these plants, since the later stage 7. In the control SR1, equivalent concentrations are only observed at the later stages of development. The phenotypes observed in the transgenic plants suggest that the protein encoded by S/S_F-box is involved with pistil development and with the control of pistil size. Additionally, the RNAi plants showed the phenotype of loss of apical dominance. The expression levels of the S/S_F-box gene were evaluated in plants with increased auxin production in the stigma/style (plants STIG1prom::iaaM), showing that this gene is not transcriptionally regulated by this hormone. Subcellular localization experiments, carried out by transient expression of the S/S_F-box sequence fused to the reporter genes GFP and YFP V (S/S_F-box::GFP; S/S_F-box::YFP), showed that the S/S_F-box protein is localized in the cytoplasm and in the nucleus. Additionally, the screening of a stigma/style cDNA library constructed on the yeast two hybrid system was performed, to investigate candidate proteins for S/S_F-box protein interaction. The results indicated interaction between S/S_Fbox and the SKP1 protein, confirming the involvement of the S/S_F-box protein in the SCF complex, which promotes degradation of target proteins via ubiquitin-proteasome. Two candidates for target proteins were identified: the transcription factors VOZ1 and SIP1, both involved in cell proliferation. In summary, it is possible to propose that the protein encoded by S/S_F-box has functions related to cell proliferation and organ development, including the pistil.

L'activació sostinguda de Hog1 porta a una inhibició del creixement cel·lular. En aquest treball, hem observat que el fenotip de letalitat causat per l'activació sostinguda de Hog1 és parcialment inhibida per la mutació del complexe SCFCDC4. La inhibició de la mort causada per l'activació sostinguda de Hog1 depèn de la via d'extensió de la vida. Quan Hog1 s'activa de manera sostinguda, la mutació al complexe SCFCDC4 fa que augmenti l'expressió gènica depenent de Msn2 i Msn4 que condueix a una sobreexpressió del gen PNC1 i a una hiperactivació de la deacetilassa Sir2. La hiperactivació de Sir2 és capaç d'inhibir la mort causada per l'activació sostinguda de Hog1. També hem observat que la mort cel·lular causada per l'activació sostinguda de Hog1 és deguda a una inducció d'apoptosi. L'apoptosi induïda per Hog1 és inhibida per la mutació al complexe SCFCDC4. Per tant, la via d'extensió de la vida és capaç de prevenir l'apoptosi a través d'un mecanisme desconegut. / Sustained Hog1 activation leads to an inhibition of cell growth. In this work, we have observed that the lethal phenotype caused by sustained Hog1 activation is prevented by SCFCDC4 mutants. The prevention of Hog1-induced cell death by SCFCDC4 mutation depends on the lifespan extension pathway. Upon sustained Hog1 activation, SCFCDC4 mutation increases Msn2 and Msn4 dependent gene expression that leads to a PNC1 overexpression and a Sir2 deacetylase hyperactivation. Then, hyperactivation of Sir2 is able to prevent cell death caused by sustained Hog1 activation. We have also observed that cell death upon sustained Hog1 activation is due to an induction of apoptosis. The apoptosis induced by Hog1 is decreased by SCFCDC4 mutation. Therefore, lifespan extension pathway is able to prevent apoptosis by an unknown mechanism.