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Publico-00197.pdf: 1371304 bytes, checksum: c513b282e60ab12fa193b0ce8b343766 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / No presente trabalho avaliou-se o papel das proteínas de membrana de lisossomos, LAMP-1 e LAMP-2 no processo de invasão de amastigotas extracelulares de T. cruzi. Foram utilizadas células MEF (murine embrionic fibroblast) nocaute para uma ou ambas as proteínas. Três diferentes pares linhagens de células selvagem/duplo nocaute foram utilizados, além de uma linhagem de célula nocaute para LAMP-1 e uma para LAMP-2. Amastigotas extracelulares invadiram mais eficientemente duas das células duplo nocaute, mas não uma terceira. Quando comparado às células selvagem, os amastigotas também invadiram mais eficientemente as células nocaute para LAMP-2, mas não as LAMP-1 nocaute. Adicionalmente, tanto células HeLa, quanto duas linhagens de MEF selvagem foram tratadas com siRNA para as proteínas LAMP. O tratamento promoveu diminuição na expressão das referidas proteínas, mas não houve diferença significativa na invasão entre as células tratadas e as células controle, indicando que essas proteínas não são importantes na invasão dos amastigotas extracelulares. Para explicar a maior permissividade à invasão em determinados tipos celulares, a taxa de exocitose de lisossomos foi avaliada. Felizmente, uma maior taxa de exocitose de lisossomos correlacionou-se com maior taxa de infectividade. Além disso, uma cinética de aquisição do marcador lisossomal CD63/LIMP-2 mostrou que nas células em que a taxa de invasão é maior em relação à célula selvagem correspondente, a aquisição do marcador lisossomal é maior em tempos iniciais de invasão, corroborando a importância da exocitose de lisossomos no processo de invasão. Ademais uma cinética de aquisição de marcador lisossomal (LAMP-1, neste caso) também foi realizada em células HeLa e Vero e foi demonstrado que também nestas células os amastigotas extracelulares de T. cruzi valeram-se da exocitose de lisossomos para o sítio de internalização do parasita. Finalmente, estudos anteriores realizados com as mesmas células MEF nocaute para LAMP utilizadas aqui haviam demonstrado que proteínas LAMP são necessárias para a fusão do fagossomo com o lisossomo no caso da fagocitose mediada por receptor. Porém, surpreendentemente, aqui foi possível notar vacúolos parasitóforos claramente marcados com CD63/LIMP-1 nas células duplo nocaute, indicando que, ao menos nas células MEF os AE de T. cruzi invadiram as células por um mecanismo diferente da fagocitose mediada por receptor. / In the present work the role of LAMP-1 and LAMP-2 in invasion by extracellular amastigotes of T. cruzi was evaluated. Murine embryonic fibroblast (MEF) knockout for one or both proteins were used. Three different pairs of wild type/double knockout cells were used, besides one single LAMP-1 or LAMP-2 knockouts cell lineage. Extracellular amastigotes invasion rate was higher for two of the double knockout clones but not for the other one. When compared to their respective wild type clones, the extracellular amastigotes showed higher infectivity in LAMP-2 knockouts, but no difference was seen in LAMP-1 knockout cells. In addition, HeLa and two wild type lineages of MEFs were submitted to siRNA treatment. Although the siRNA treatment was efficient, since down regulation in protein expression was observed, there was no difference in amastigotes cell invasion in cells treated in comparison to the controls. These results indicated that LAMP proteins were not important to extracellular amastigotes cell invasion. To explain the reason for a higher invasion rate observed in some cells, lysosomal exocytosis was evaluated. Fortunately, higher lysosomal exocytosis correlated with a higher invasion rate. Moreover, it was performed a CD63/LIMP-2 acquisition kinetics and the same cells that showed higher invasion rate, presented higher lysosomal marker acquisition in early invasion times. Taken together, these findings suggest that lysosomal exocytosis was important to amastigotes cell invasion. Lysosomal marker acquisition kinetics (LAMP-1 here) were performed also in HeLa and Vero cells. Once again lysosome exocytosis was important to extracellular amastigotes cell invasion. Finally, previous results with the same MEFs used in this study demonstrated that LAMP proteins were essential to phagosome-lysosome fusion. Here, it was demonstrated that in knockout cells parasitophorous vacuoles are clearly CD63/LIMP-1 stained, indicating that in MEFs, extracellular amastigotes enter cells by a mechanism other than receptor-mediated phagocytosis. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.unifesp.br:11600/8825 |
| Date | 30 September 2009 |
| Creators | Gaspar, Emanuelle Baldo [UNIFESP] |
| Contributors | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), Mortara, Renato Arruda [UNIFESP] |
| Publisher | Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | 125 p. |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIFESP, instname:Universidade Federal de São Paulo, instacron:UNIFESP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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