Els efectes beneficiosos que els oligosacàrids de la llet materna (OLM) confereixen a la salut dels lactants s'ha estudiat durant anys. Aquests oligosacàrids proporcionen una barrera protectora i un suport nutritiu essencials, als quals no tenen accés els nens que no prenen llet materna. La llet humana és considerada única respecte a la resta de llets de mamífers pel que fa a la quantitat i la complexitat d'oligosacàrids. Actualment, s'han identificat més de 130 estructures químiques diferents de OLM, i no es disposa de cap recurs natural que proporcioni accés a aquestes estructures tan complexes i a bastament. De la mateixa manera, la síntesi química és complicada a causa de l'estructura tan complexa i diversa que presenten els OLM, i de moment, la síntesi en gran escala no ha estat possible. La síntesi enzimàtica, en canvi, es presenta com una eina alternativa de síntesi d'aquestes molècules complexes atès que, en la naturalesa els enzims són els responsables de formar enllaços glicosídics entre carbohidrats amb alta regio- i estereoselectivitat.
L'objectiu d'aquesta tesi és avaluar l'ús de l'enzim Lacto-N-biosidasa de Bifidobacterium bifidum (LnbB) com un biocatalizador eficient des de dues perspectives diferents: i) l'estudi estructural-funcional de LnbB i ii) la generació de biocatalizadors capaços de sintetitzar l'oligosacàrid d'interès (lacto-N-tetraosa) mitjançant enginyeria de proteïnes en l'enzim LnbB.
En aquesta tesi, hem analitzat l'organització dels dominis dels enzims de la família GH20, i, en conseqüència, hem definit dos models d'arquitectures. El Model A conté almenys dos dominis, un domini GH20b no catalític i el GH20 catalític, que sempre es presenta acompanyat d'una α-hèlix extra. En canvi, el Model B consisteix únicament en el domini catalític GH20. Mitjançant l'expressió de diferents formes truncades de LnbB, hem descrit els requeriments estructurals per a la funcionalitat dels enzims GH20, i en particular per LnbB, per tal d’obtenir la unitat funcional mínima que conservi l'activitat enzimàtica.
Respecte a la síntesi de la lacto-N-tetraosa usant com a biocatalizador noves proteïnes de LnbB obtingudes mitjançant enginyeria de proteïnes, hem contemplat dues estratègies enzimàtiques diferents. En primer lloc, l'estratègia de glicosintasa, en la qual l'enzim (amb mutació en el residu assistent) és capaç de transferir el corresponent donador activat (sucre sintètic derivat d’oxazolina) a un acceptor, sense hidròlisi del producte. En segon lloc, l'estratègia de transglicosilació millorada, en la qual, una nova generació de mutants en els llocs d'unió a l'acceptor seran capaços d'acomodar de manera més favorable un sucre en lloc d'una molècula d'aigua, i d'aquesta manera, augmentar l'activitat de transglicosilació. / Los efectos beneficiosos que los oligosacáridos de la leche materna (OLM) confieren a la salud de los lactantes se han estudiado durante años. Estos oligosacáridos proporcionan una barrera protectora y un soporte nutritivo esenciales, a los que, los niños que no toman leche materna no tienen acceso. La leche humana se considerada única respecto al resto de leches de mamíferos en cuanto a cantidad y complejidad de oligosacáridos. Actualmente, se han identificado más de 130 estructuras químicas diferentes de OLM, y no se dispone de ningún recurso natural que proporcione acceso a estas estructuras tan complejas y en cantidad suficiente. Del mismo modo, la síntesis química es complicada debido a la estructura tan compleja y diversa que presentan los OLM, y por el momento, la síntesis en gran escala no ha sido posible. La síntesis enzimática, en cambio, se presenta como una herramienta alternativa de síntesis de éstas moléculas complejas dado que, en la naturaleza las enzimas son las responsables de formar enlaces glicosídicos entre carbohidratos con alta regio- y estereoselectividad.
El objetivo de esta tesis es evaluar el uso del enzima Lacto-N-biosidase de Bifidobacterium bifidum (LnbB) como un biocatalizador eficiente desde dos perspectivas diferentes: i) el estudio estructural-funcional de LnbB y ii) la generación de biocatalizadores capaces de sintetizar el oligosacárido de interés (lacto-N-tetraosa) mediante ingeniería de proteínas en el enzima LnbB.
En esta tesis, hemos analizado la organización de los dominios de enzimas GH20, y, en consecuencia, hemos definido dos modelos de arquitecturas de dominio. El Modelo A contiene al menos dos dominios, un dominio GH20b no catalítico y el GH20 catalítico, que siempre se presenta acompañado de una α-hélice extra. Por el contrario, el Modelo B consiste únicamente en el dominio catalítico GH20. Mediante la expresión de diferentes formas truncadas de LnbB, hemos descrito los requerimientos estructurales para la funcionalidad de las enzimas GH20, y en particular para LnbB, de modo que se obtenga la unidad funcional mínima que conserve la actividad enzimática.
Respecto a la síntesis de la lacto-N-tetraosa usando como biocatalizador nuevas proteínas de LnbB obtenidas mediante ingeniería, hemos contemplado dos estrategias enzimáticas diferentes. En primer lugar, la estrategia de glicosintasa, en la que el enzima (un mutante en el residuo asistente) es capaz de transferir el correspondiente dador activado (azúcar sintético derivado de oxazolina) a un aceptor, sin hidrólisis del producto. En segundo lugar, la estrategia de transglicosilación mejorada, en la que, una nueva generación de mutantes en los sitios de unión al aceptor serán capaces de acomodar de manera más favorable un aceptor de azúcar en lugar de una molécula de agua, y de este modo, aumentar la actividad de transglicosilación. / The potential health benefits of human milk oligosaccharides (HMO) have been studied for many years. It is well known that these oligosaccharides provide a protective barrier and nutritive support that infants with poor access to breast milk do not acquire in the first years of life. Human milk is considered to be unique among mammals in terms of the quantity and complexity of its oligosaccharides. To date, 130 chemical structures within HMO have been identified. No other natural resources provide access to these complex oligosaccharides in such large amounts, and until now, large scale synthesis of HMO has not been possible by any traditional organic chemistry methodology. Enzymatic synthesis is an alternative synthetic tool since enzymes can form the new glycosidic linkage between carbohydrates with high regio- and stereoselectivity.
The objective of this thesis is to evaluate the use of Lacto-N-biosidase from Bifidobacterium bifidum (LnbB) as an efficient biocatalyst in the following two ways: i) the structural-functional study of LnbB and ii) protein engineering of LnbB to generate biocatalysts able to synthesize the target lacto-N-tetraose.
Here, we have analysed the domain organization of GH20 enzymes, and accordingly, have defined two models of domain architectures. Model A, contains at least two domains, a non-catalytic GH20b domain, and the catalytic GH20 which is always accompanied with an extra α-helix. In contrast, Model B consists only of the catalytic GH20 domain. By expressing different truncated forms of LnbB, we have described the structural requirements for functionality of GH20 enzymes, and in particular for LnbB, to obtain a minimal functional unit that retains the enzymatic activity.
With regard to the synthesis of lacto-N-tetraose using new engineered LnbB proteins as biocatalysts, we envisage two different enzymatic strategies. First, the glycosynthase strategy, in which the activated donor is the corresponding synthetic sugar oxazoline and the enzyme, a mutant on the assisting residue, is able to transfer the donor to an acceptor without hydrolysis of the product. Second, the enhanced transglycosidase strategy, in which, a new generation of mutants on the acceptor subsites of the enzyme will be able to more favourably accommodate a sugar acceptor instead of water, and thus, increase transglycosylation activity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_URL/oai:www.tdx.cat:10803/387327 |
| Date | 08 July 2016 |
| Creators | Val Cid, Cristina |
| Contributors | Planas Sauter, Antoni, Faijes Simona, Magda, Universitat Ramon Llull. IQS SE - Bioenginyeria |
| Publisher | Universitat Ramon Llull |
| Source Sets | Universitat Ramon Llull |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 263 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0076 seconds