Contexte : Au cours de la dernière décennie, le nombre de personnes en attente d’une
transplantation cardiaque a augmenté d’environ 25%, tandis que le nombre de greffes effectuées
chaque année est resté stable. Le taux de décès des patients en attente d’une greffe cardiaque
est d’environ 15-20%. Le don d’organe suite à un décès cardiocirculatoire (DDC) est une
alternative au don après décès neurologique (DDN) qui a permis d’augmenter le nombre
d’organes disponibles comme les poumons, les reins et les foies. Compte tenu de la survenue
d’une mort cardiovasculaire dans les protocoles DDC, le cœur est rarement greffé à cause des
dommages infligés durant la période d’ischémie chaude. Notre équipe a précédemment
démontré que l’utilisation du Celastrol, ainsi que notre analogue synthétique inhibiteur de la
HSP90 ont des effets cardioprotecteurs, quand administrés au moment de la reperfusion dans
des modèles in vitro de culture cellulaire et ex vivo dans des cœurs de rats montés sur le système
de perfusion Langendorff. L’objectif est d’évaluer les mécanismes cardioprotecteurs rapides
d’une nouvelle formulation de l’inhibiteur HSP90, et de comprendre l’efficacité de ce nouveau
composé synthétique sur deux lignées de cellules : les cardiomyoblastes H9c2 issus de rats et les
cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (iPSC-CMs).
Méthodes/Résultats : Les cellules H9c2 et iPSC-CMs ont été cultivées. La signalisation cellulaire a
été analysée par western blot pour évaluer le niveau d’activation de ces différentes voies. Suite à
l’optimisation des conditions pour les cellules iPSC-CMs, les deux lignées cellulaires ont été mises
en condition ischémique (sans glucose, 95% N2, 5% CO2) durant la nuit, puis reperfusées, en
conditions normales, avec différentes concentrations de l’inhibiteur HSP90. La viabilité cellulaire
ainsi que l’ouverture des pores mitochondriaux (mPTP) ont été évaluées à l’aide de kits
d’analyses, la production de radicaux libres d’oxygène à l’aide de kits de fluorescence et
l’expression des ARN messagers de gènes antioxydants à l’aide de la réaction en chaîne par
polymérase (PCR).
Les résultats ont montré une augmentation de l’activation des voies cytoprotectrices quand les
deux lignées cellulaires étaient traitées à la concentration 10-6M du composé sans stress
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ischémique : augmentation de HO-1 and HSP-70 dans les 30 premières minutes et AKT et ERK
après 1 heure de traitement et 3 heures de récupération. Contrairement à nos attentes, le
traitement au moment de la reperfusion à la concentration 10-6M a montré une diminution de la
viabilité des cellules, alors que la concentration 10-7M l’a augmenté. À une concentration de 10-
7M, il y a eu diminution de la production de radicaux libres comparativement au groupe témoin.
Comme attendu, cette concentration a aussi démontré une diminution de l’ouverture des mPTP.
Tous ces résultats ont été observés, autant dans les cellules humaines que celles de rats. Une
évaluation préliminaire de l’expression des gènes antioxydants dans les cellules H9c2 a seulement
montré une augmentation de l’expression des gènes CAT et HO-1.
Conclusion : Notre groupe de recherche a précédemment démontré l’efficacité des composés
issus du Celastrol sur la réduction des dommages myocardiques dus à la reperfusion dans les
modèles d’ischémie, incluant l’infarctus du myocarde et la donation après décès
cardiocirculatoire. Ces expériences ont montré les effets bénéfiques du nouveau composé
synthétique sur l’expression des gènes antioxydants, et sur l’activation d’une série de voies
cytoprotectrices permettant la stabilisation de la membrane mitochondriale, réduisant aussi la
production de radicaux libres, et améliorant ultimement la survie cellulaire. Des études
supplémentaires sont en cours afin d’améliorer la compréhension des modes d’action, des
mécanismes et des dosages optimaux du médicament, ce qui nous permettra de commencer les
essais sur animaux dans le but d’introduire cette molécule en clinique dans le contexte de don
d’organes. / Background: During the last decade, the number of people waiting for a cardiac transplantation
has increased by about 25%, while the number of yearly transplant surgeries performed has
remained steady. The death rate of patients awaiting heart transplant is about 15-20%. Organ
donation after circulatory death (DCD) is an alternative to donation after neurological death
(DND) that has allowed to increase the number of available organs like lungs, livers, and kidneys.
However, because of the cardiac death in DCD protocols, the heart is rarely used because of the
injuries suffered by the warm ischemia period. Our group has previously shown that Celastrol,
along with a synthetic HSP90 inhibitor analog, have cardioprotective effects when given as
postconditioning agents at the moment of reperfusion in an in vitro model on cellular cultures
and an ex vivo model on rat hearts mounted on a Langendorff perfusion system. The objective is
to evaluate the rapid cardioprotective mechanisms of a novel formulation of the HSP90 inhibitor
compound, and to understand the efficacy of this new synthetic compound on two cell lines: rat
H9c2 cardiomyoblasts and human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (iPSCCMs).
Methods/Results: H9c2 rat cardiomyoblasts and human iPSC-CMs were cultured. Cell signaling
was analyzed by western blot to evaluate pathway activations. Both cell lines were put in ischemic
conditions (no glucose, 95% N2, 5% CO2) overnight, then reperfused (normal conditions) with
different concentrations of HSP90i after optimizing the human iPSC-CMs’ stress experiment. Cell
viability and mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening were evaluated using
assays, oxygen-free radical production by fluorescence assay and antioxidant gene messenger
RNA expression via polymerase chain reaction (PCR).
Results showed an increase in cytoprotective pathway activation when both cell lines were
treated with 10-6M of the compound without any stress: HO-1 and HSP-70 in the first 30 minutes
while AKT and ERK after 1 hour of treatment and 3 hours of recuperation. Interestingly, treatment
with the compound at 10-6M at the moment of reperfusion showed decreased viability of the cells
while 10-7M improved it. Free radical production was also decreased at a concentration of 10-7M
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when compared to the baseline, and as expected, the compound also decreased mPTP opening.
These results were seen in both human and rat cell lines. Preliminary evaluation of antioxidant
gene expression in H9c2 cells only showed an increase in the expression of the cytoprotective
CAT and HO-1 genes.
Conclusion: Our research group has previously demonstrated the efficacy of Celastrol compounds
in reducing reperfusion damage in myocardial ischemia models, including myocardial infarction
and donation after circulatory death. These experiments have shown that the beneficial effects
of this new synthetic compound include the expression of antioxidant genes and the launching of
a series of cytoprotective pathways that stabilize the mitochondrial membrane, reduce free
radical production, and improve cell survival. Additional studies to fully understand the mode of
action, the mechanisms and the optimal dosages are underway to allow us to move to animal
trials in order to ultimately introduce the molecule in the clinical field in the context of organ
donation.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/32158 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Khalil, Khalil |
| Contributors | Noiseux, Nicolas |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | thesis, thèse |
| Format | application/pdf |
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