A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-28052009-115250 |
| Date | 31 August 2007 |
| Creators | Rigos, Carolina Fortes |
| Contributors | Ciancaglini, Pietro, Ward, Richard John |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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