La presente tesis doctoral tiene como objetivo la creación de un modelo de comportamiento hidráulico que permita analizar subunidades de riego localizado. Para ello, se ha realizado una exhaustiva revisión bibliográfica a partir de la cual se ha establecido un conjunto de expresiones, fórmulas, métodos y procedimientos a aplicar al citado modelo. Con esto se pretende que los análisis efectuadossean lo másrealistas posible al considerarse la mayor parte de las variables que intervienen en el funcionamiento de las subunidades. Uno de los factores más importantes es el comportamiento de los emisores por lo que se han realizado una serie de ensayos de emisores comerciales en el laboratorio de riego localizado del departamento de Ingeniería Rural. A partir de estos se han deducido expresiones que permiten predecir tanto el caudal arrojado por cada uno de ellos como el coeficiente de variación de fabricación del conjunto. La clave está en considerar todos los emisores de forma independiente, estudiando las distribuciones de los coeficientes de ajuste, tanto en la versión potencial como en la parabólica. Otro de los aspectos cruciales es la consideración de la aleatoriedad de los emisores, para lo cual, utilizando las distribuciones de los coeficientes de ajuste, que se supone que son normales, se genera una población virtual de emisores. De dicha población se extrae una muestra aleatoria cuyo tamaño coincide con el número total de emisores de la subunidad estudiada y se distribuye también aleatoriamente por todas las posiciones posibles. Así se consigue simular una situación real.    También se han tratado con profusión los aspectos hidráulicos de las subunidades, especialmente en lo que respecta al cálculo de las pérdidas de carga tanto continuas como localizadas. Estas pérdidas, junto con las diferencias de cota y las alturas cinéticas, definen las presiones de funcionamiento de todos los emisores que introducidas en las ecuaciones de ajuste individuales, permiten predecir el caudal arrojado por cada uno de ellos. Una vez definidas las distribuciones de presiones y caudales es preciso determinar la uniformidad de distribución del agua de riego, lo que se hace mediante diversos coeficientes de uniformidad tanto a efectos de análisis como a efectos de diseño. De esta forma se puede comprobar si una subunidad de riego cumple los criterios de uniformidad establecidos. El modelo generado recoge todos estos aspectos por lo que es bastante complejo de ahí que se ha elaborado una aplicación informática en entorno Windows® utilizando el lenguaje de programación Visual Basic 6.0®. Esta aplicación, denominada ANASUB, permite realizar simulaciones de subunidades reales de forma rápida y sencilla. / Turégano Pastor, JV. (2014). Modelización del comportamiento hidráulico de una subunidad de riego localizado [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/39354 / TESIS

A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

A Na,K-ATPase é uma proteína encontrada na membrana plasmática de praticamente todas as células animais, que utiliza a energia derivada da hidrólise do ATP para transportar 3 íons Na+ e 2 íons K+. É composta por duas subunidades denominadas e . Um aspecto que ainda gera controvérsias se refere à sua forma de associação nativa e funcional como um protômero ou ainda na forma de oligômeros ()2 ou ()4. Uma forma de estudar essa enzima é pela sua solubilização da membrana, e posteriormente reconstituição em lipossomos de DPPC:DPPE. A caracterização cinética e estrutural desse sistema mostra que a enzima se apresenta na forma oligomérica ()2. O objetivo desse trabalho foi avaliar os mecanismos de dissociação e de desnaturação da Na,K-ATPase solubilizada bem como da reconstituída em lipossomos de DPPC:DPPE, por agentes físicos (temperatura) e químicos (relação proteína:detergente, uso de agentes caotrópicos como a guanidina e mudanças de pH), para interpretar as suas formas de associação e regulação. Para isso, foram realizados experimentos de dicroísmo circular (CD), calorimetria (DSC), infravermelho (FTIR), fluorescência de emissão do triptofano, tensão superficial, elasticidade, atividade catalítica (ATPase e pNPPase). Os estudos de CD em função da variação de temperatura mostraram que ocorre uma transição na curva de elipticidade (222 nm) a 43,7°C para a enzima solubilizada e a 42,0°C para a enzima reconstituída em lipossomos. Estas transições foram também encontradas pela técnica de FTIR. Os experimentos por DSC para a enzima solubilizada revelaram a presença de três picos em 54,7; 64,7 e 67,8°C. Já para a enzima reconstituída observam-se transições em menores temperaturas entre 30 a 40ºC (referentes aos lipídios) e ainda a preservação do pico de transição para proteína em 68,0°C. A análise de fluorescência de triptofano para ambas formas de enzima revelou deslocamentos de pico máximo de emissão a partir de 60°C. Já a presença de guanidina mostrou dois pontos de transição em 3 e 5 mol.L-1 para a Na,K-ATPase solubilizada. O efeito de diferentes meios tamponantes revelou que a enzima apresenta maiores conteúdos em -hélice em pH 7,5, concomitante com um aumento na intensidade de emissão de fluorescência do triptofano na faixa de pH de 5,0 a 8,5. Analisando conjuntamente todas as técnicas podemos propor um mecanismo de dissociação/desnaturação da enzima em função da temperatura. Primeiramente a enzima passa do seu estado oligomérico ()2 e forma protômeros . A atividade ATPase é perdida completamente (acima de 60ºC) quando as subunidades são completamente separadas, ocorrendo então uma agregação das subunidades , através dos domínios citoplasmáticos. Finalmente, a análise da enzima em diferentes proporções de proteína:detergente revela que a Na,K-ATPase, na presença de concentrações abaixo da CMC, se encontra na forma ()2 ou ainda ()4 (dependendo da concentração de proteína). Já para concentrações acima da CMC ocorre a separação das subunidades e consequente perda de atividade catalítica. Devido à dependência da atividade ATPase com seu estado conformacional e seu estado de oligomerização, este estudo realizado por técnicas bioquímicas e biofísicas, resulta em novas informações acerca da compreensão dos mecanismos que controlam o processo de associação, o qual é importante para a função da enzima na membrana natural. / Na,K-ATPase is a protein found in the plasmatic membrane of almost all animal cells and it uses the energy from ATP hydrolysis to transport 3 Na+ ions and 2 K+ ions. It is formed by subunits called and. One controversial aspect refers to its native and functional association form as a protomer or still in ()2 or ()4 oligomers form. One way to study this protein in our laboratory is by its solubilization from membrane, and later reconstitution in liposome from DPPC:DPPE. The kinetic and structural characterization fo this system shows that the enzyme presents itself in the oligomeric form ()2. The aim of this work was to evaluate the dissociation and denaturation mechanisms of the solubilized NA,K-ATPase as well as the one reconstituted in DPPC:DPPE liposome, by physic (temperature) and chemical agents (relation protein:detergent, use of chaotropic agents as Guanidine chloride, or still by the pH changes, to interpret its association and regulation forms. To that end, experiments of circular dichroism (CD), calorimetry (DSC), superficial tension, elasticity , catalytic activity (ATPase an pNPPase) were done. The CD studies in function of temperature variation have shown that a transition occurs in the ellipticity curve (222 nm) at 43.7ºC for the solubilized enzyme and at 42.0ºC for the enzyme reconstituted in liposome. These transitions were also found by the FTIR technique. The experiments by DSC for the solubilized enzyme have shown the presence of three peaks at 54.7ºC, 64.7ºC and 67.8ºC. As for the reconstituted enzyme, transitions in lower temperatures between 30ºC and 40ºC (concerning the lipids) and also the preservation of the transition peak for the protein at 68.0ºC were observed. The Tryptophane fluorescence analysis for both enzyme forms has revealed emission maximum peak shifts starting from 60ºC. The Guaniddine presence has shown two transition points at 3 and 5 mol.L-1 for the solubilized Na,K-ATPase. The effect of different buffer media has shown that the enzyme presents higher contents in -helix at pH 7.5, concomitant with an increase of the intensity of tryptophane fluorescence emission in the pH range of 5.0 to 8.5. Analyzing all the techniques together we can propose a dissociation/denaturation mechanism in function of the temperature. First, the enzyme goes from its oligomeric ()2 state and forms protomers. The ATPase activity é totally lost ( over 60ºC) when the subunits are completely separated, when an subunits aggregation then occurs, through the cytoplasmatic domains. Finally, the analysis of the enzyme in different proportions of protein:detergent reveals that the NA,K-ATPase, in the presence of concentrations bellow CMS, is in the ()2 or yet in the ()4 form (Depending on protein concentration). Now for concentrations above CMS, the separation of the subunits occurs and consequent catalytic activity loss. Due to the ATPase activity dependence on its conformational form and oligomerization state, this study done with biophysical and biochemistry techniques, results in new information on the comprehension of the mechanisms that control the association processes, which is important to the enzyme function in the natural membrane.

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 ± 100 e 3700 ± 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 ± 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de β-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp. / The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 ± 100 and 3700 ± 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 ± 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.

Introdução: Os receptores ionotrópicos do glutamato, como o N-metil-D-Aspartato (NMDA), estão envolvidos em desordens psiquiátricas. NMDARs são complexos heteroméricos que incorporam tres diferentes subunidades: NR1, NR2 e NR3. Objetivos: quantificar os níveis plasmáticos das subunidades NR1 e NR2 NMDAR em pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP), em comparação com os irmãos e controles saudáveis. Métodos: Este é um estudo transversal de PEP na região de Ribeirão Preto, Brasil, sendo o grupo controle composto por indivíduos saudáveis, pareados por idade, sexo e mesma área de abrangência dos casos. Foram coletados 5 mL de amostra de sangue próxima a data de diagnóstico de PEP. A quantificação plasmática das subunidades NR1 e NR2 foi realizada por ELISA. Os dados foram analisados por ANOVA (significante se p<0,05) e curva ROC. Resultados: Foram incluídos 166 pacientes em PEP (idade: x = 30,34 ± 12,2 anos; 64% homens), destes 84 com diagnóstico de psicose não afetiva, 51 com transtorno bipolar e 31 com transtorno depressivo. Foram tambem incluídos 76 irmãos e 166 controles saudáveis. Os níveis plasmáticos das subunidades NR1 e NR2 foram significativamente menores em pacientes com transtornos psicóticos (NR1: x = 71,0 ± 100,3 pg/mL, NR2: x = 2,5 ± 2 ng/ml), transtorno bipolar (NR1: x = 185,7 ± 319,5 pg/ml; NR2: x = 2,1 ± 2,2 ng/ml), transtorno depressivo (NR1: x = 83,2 ±185,0 pg/ml; NR2: x = 2,1± 2,1 ng/ml) em comparação com os irmãos (NR1: x = 140,6 ± 193,8 pg/ml; NR2: = 6,2 ± 1,5 ng/ml) e voluntários saudáveis (NR1: x = 146,7 ± 361,1 pg/ml; NR2: x = 4,8 ± 2,2 ng/ml) [NR1 e NR2, p < 0,001]. Indivíduos com valores plasmáticos de NR2 inferiores a 3,648 ng/mL apresentam um risco 14,72 vezes maior de estar doente (PEP) de quem não possui o NR2 abaixo deste valor. Conclusões: Este é o primeiro estudo relatando a quantificação e a redução das concentrações plasmaticas das subunidades NR1 e NR2 em transtornos psiquiátricos graves quando comparados aos irmãos e controles, podendo a subunidade NR2 ser um candidato a biomarcador plasmático em pacientes com PEP. / Background: Ionotropic glutamate receptors, such as N-Methyl-D-Aspartate (NMDA), are involved in pathophysiology of several psychiatric disorders. NMDARs are described as heteromeric complexes incorporating distincts subunits within a repertoire of three types: NR1, NR2 and NR3. Aim: to quantify the NR1 and NR2 subunits NMDAR plasma levels in patients with first episode psychosis (FEP), compared with siblings and healthy controls. Methods: This is a cross-sectional study of FEP conducted in Ribeirão Preto, Brazil. The control group were composed by healthy subjects matched for age, sex and same coverage area of cases. 5 ml of blood sample were collected next to the date of FEP diagnosis. NR1 and NR2 subunits plasmatic quantification was performed by ELISA. Data were analyzed by ANOVA (significant at p < 0.05) and ROC curve. Results: FEP sample comprised 166 patients (age: x = 30.34 ± 12.2 years; 64% men), of these 84 with a diagnosis of psychotic disorder, 51 with bipolar disorder and 31 with depressive disorder. It was also included 76 siblings and 166 healthy controls. NR1 and NR2 subunits plasma levels were significantly lower in patients with psychotic disorders (NR1: x = 71.0 ± 100.3 pg / ml, NR2: x = 2.5 ± 2 ng/ml), bipolar disorder (NR1: x = 185.7 ± 319.5 pg/mL; NR2: x = 2.1 ± 2.2 ng/ml), depressive disorders (NR1: x = 83.2 ± 185.0 pg/mL; NR2: x = 2.1 ± 2.1 ng/ml) compared with siblings (NR1: x = 140.6 ± 193.8 pg/mL; NR2: x = 6.2 ± 1.5 ng/ml) and healthy volunteers (NR1: x = 146.7 ± 361.1 pg / mL; NR2: x = 4.8 ± 2.2 ng/ml) [NR1 and NR2, p < 0.001]. Interestingly, individuals with NR2 plasma values less than 3.648 ng/ml present 14.72 times a higher risk to be in FEP than other patients. Conclusions: This is the first study reporting the measurement and reduction of NR1 and NR2 subunits plasma concentrations in severe psychiatric disorders when compared to siblings and controls. And highlighting that NR2 subunit can be a candidate for plasma biomarker in patients with FEP.

A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 &plusmn; 100 e 3700 &plusmn; 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 &plusmn; 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de &beta;-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp. / The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 &plusmn; 100 and 3700 &plusmn; 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 &plusmn; 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.

Introdução: Os receptores ionotrópicos do glutamato, como o N-metil-D-Aspartato (NMDA), estão envolvidos em desordens psiquiátricas. NMDARs são complexos heteroméricos que incorporam tres diferentes subunidades: NR1, NR2 e NR3. Objetivos: quantificar os níveis plasmáticos das subunidades NR1 e NR2 NMDAR em pacientes em primeiro episódio psicótico (PEP), em comparação com os irmãos e controles saudáveis. Métodos: Este é um estudo transversal de PEP na região de Ribeirão Preto, Brasil, sendo o grupo controle composto por indivíduos saudáveis, pareados por idade, sexo e mesma área de abrangência dos casos. Foram coletados 5 mL de amostra de sangue próxima a data de diagnóstico de PEP. A quantificação plasmática das subunidades NR1 e NR2 foi realizada por ELISA. Os dados foram analisados por ANOVA (significante se p<0,05) e curva ROC. Resultados: Foram incluídos 166 pacientes em PEP (idade: x = 30,34 ± 12,2 anos; 64% homens), destes 84 com diagnóstico de psicose não afetiva, 51 com transtorno bipolar e 31 com transtorno depressivo. Foram tambem incluídos 76 irmãos e 166 controles saudáveis. Os níveis plasmáticos das subunidades NR1 e NR2 foram significativamente menores em pacientes com transtornos psicóticos (NR1: x = 71,0 ± 100,3 pg/mL, NR2: x = 2,5 ± 2 ng/ml), transtorno bipolar (NR1: x = 185,7 ± 319,5 pg/ml; NR2: x = 2,1 ± 2,2 ng/ml), transtorno depressivo (NR1: x = 83,2 ±185,0 pg/ml; NR2: x = 2,1± 2,1 ng/ml) em comparação com os irmãos (NR1: x = 140,6 ± 193,8 pg/ml; NR2: = 6,2 ± 1,5 ng/ml) e voluntários saudáveis (NR1: x = 146,7 ± 361,1 pg/ml; NR2: x = 4,8 ± 2,2 ng/ml) [NR1 e NR2, p < 0,001]. Indivíduos com valores plasmáticos de NR2 inferiores a 3,648 ng/mL apresentam um risco 14,72 vezes maior de estar doente (PEP) de quem não possui o NR2 abaixo deste valor. Conclusões: Este é o primeiro estudo relatando a quantificação e a redução das concentrações plasmaticas das subunidades NR1 e NR2 em transtornos psiquiátricos graves quando comparados aos irmãos e controles, podendo a subunidade NR2 ser um candidato a biomarcador plasmático em pacientes com PEP. / Background: Ionotropic glutamate receptors, such as N-Methyl-D-Aspartate (NMDA), are involved in pathophysiology of several psychiatric disorders. NMDARs are described as heteromeric complexes incorporating distincts subunits within a repertoire of three types: NR1, NR2 and NR3. Aim: to quantify the NR1 and NR2 subunits NMDAR plasma levels in patients with first episode psychosis (FEP), compared with siblings and healthy controls. Methods: This is a cross-sectional study of FEP conducted in Ribeirão Preto, Brazil. The control group were composed by healthy subjects matched for age, sex and same coverage area of cases. 5 ml of blood sample were collected next to the date of FEP diagnosis. NR1 and NR2 subunits plasmatic quantification was performed by ELISA. Data were analyzed by ANOVA (significant at p < 0.05) and ROC curve. Results: FEP sample comprised 166 patients (age: x = 30.34 ± 12.2 years; 64% men), of these 84 with a diagnosis of psychotic disorder, 51 with bipolar disorder and 31 with depressive disorder. It was also included 76 siblings and 166 healthy controls. NR1 and NR2 subunits plasma levels were significantly lower in patients with psychotic disorders (NR1: x = 71.0 ± 100.3 pg / ml, NR2: x = 2.5 ± 2 ng/ml), bipolar disorder (NR1: x = 185.7 ± 319.5 pg/mL; NR2: x = 2.1 ± 2.2 ng/ml), depressive disorders (NR1: x = 83.2 ± 185.0 pg/mL; NR2: x = 2.1 ± 2.1 ng/ml) compared with siblings (NR1: x = 140.6 ± 193.8 pg/mL; NR2: x = 6.2 ± 1.5 ng/ml) and healthy volunteers (NR1: x = 146.7 ± 361.1 pg / mL; NR2: x = 4.8 ± 2.2 ng/ml) [NR1 and NR2, p < 0.001]. Interestingly, individuals with NR2 plasma values less than 3.648 ng/ml present 14.72 times a higher risk to be in FEP than other patients. Conclusions: This is the first study reporting the measurement and reduction of NR1 and NR2 subunits plasma concentrations in severe psychiatric disorders when compared to siblings and controls. And highlighting that NR2 subunit can be a candidate for plasma biomarker in patients with FEP.

A síndrome de McCune Albrigth (SMA) é uma doença genética não hereditária, com incidência estimada entre 1/100.000 e 1/1.000.000 casos/ano. A SMA caracteriza-se clinicamente pela tríade: displasia óssea fibrosa (FD), manchas cutâneas café-com-leite e hiperfunção endócrina tais como: síndrome de Cushing, pseudo-puberdade precoce, hipertiroidismo, acromegalia. O diagnóstico da SMA clássica é usualmente baseado no quadro clínico associado a dosagens hormonais e exames de imagem, principalmente cintilografia do esqueleto. No entanto, quadros atípicos e formas parciais muitas vezes dificultam o diagnóstico preciso da síndrome. O objetivo deste estudo foi padronizar dentre as técnicas de PNA (peptide nucleic acid) e PCT em Tempo Real, para a detecção de polimorfismos de base única (SNPs), a técnica mais sensível para a discriminação das mutações ativadoras da subunidade da proteína G. Para este estudo foram selecionados 32 pacientes, 1 masculino e 31 femininos, com SMA, todos em seguimento no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da USP. Como resultado positivo, apresentamos nesse trabalho pela primeira vez o uso do RT-PCR genotipagem na detecção das mutações ativadoras da proteína G, em DNA extraído de tecidos afetados e em leucócitos de sangue periférico, sendo a técnica considerada sensível o suficiente para discriminar de forma simples e rápida as mutações ativadoras da PGs. Sugerimos nesse estudo o uso da técnica de discriminação alélica pelo sistema Taqman. Essa técnica possibilita a detecção destas mutações gsp no sangue periférico mesmo numa baixa porcentagem, uma vez que nem sempre o tecido afetado (gônada, osso, hipófise) é disponível. / The McCune-Albright Syndrome (MAS) is a genetic disease, with incidence estimated at 1/100.000 and 1/1000000 cases per year. MAS is clinically characterized by the triad: bone fibrous dysplasia (FD) café-au-lait skin spots and endocrine hyperfunction, such as: precocious puberty (PP), Cushing's syndrome, hyperthyroidism and acromegaly. The diagnosis of MAS is originally based on clinical characteristics associated with hormonal and imaging studies. However, atypical and partial forms often hamper the accurate diagnosis of the syndrome. For this study we selected 32 patients, 1male and 31 females, all being treated in Hospital das Clínicas, School of Medicine, University of São Paulo. As a positive result, we showed for the first time the use of Real Time PCR/genotyping for the detection of activating mutations of the stimulatory G protein, using blood leucocytes DNA. This technique was sensible and can bring fast results for the patient and the physician, making the diagnosis easier. Our study proposes the use of allelic discrimination by Taqman system, which can be used as a probe that allows the identification of specific genotypes. These techniques could help detect these mutations in peripheral blood when the affected tissue is not available.