A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N → I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I → U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N → I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I → U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 ± 100 e 3700 ± 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 ± 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de β-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp. / The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 ± 100 and 3700 ± 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 ± 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.

A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 ± 100 e 3700 ± 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 ± 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de β-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp. / The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 ± 100 and 3700 ± 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 ± 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:37:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gava_LisandraMarques_D.pdf: 9573403 bytes, checksum: 4d69a29d08ffc20e4544b876f131fb0d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A função biológica das proteínas está relacionada à sua estrutura tridimensional adquirida pelo processo de enovelamento protéico. Neste contexto, proteínas denominadas, genericamente, de chaperonas moleculares exercem papel fundamental atuando no auxílio do enovelamento correto, no reenovelamento e na dissociação de agregados protéicos. A Hsp90 é uma das chaperonas moleculares mais importantes, é essencial para a viabilidade celular em eucariotos e está normalmente associada a proteínas atuantes no ciclo e sinalização celular, o que torna essa chaperona um alvo bastante interessante para abordagens terapêuticas de diversas doenças. A Hsp90 pode ser modulada por co-chaperonas diversas. Nesse trabalho foram caracterizadas as proteínas CHsp90 (domínio C-terminal da Hsp90 humana), e as co-chaperonas Hop e Tom70, além da interação entre C-Hsp90 e Tom70. Foram aplicadas técnicas de dicroísmo circular e emissão de fluorescência do triptofano; seguidas pela caracterização por ultracentrifugação analítica, gel filtração analítica, espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de gel filtração acoplada a espalhamento de luz em multi-ângulos (SEC-MALS) e gel nativo. Para os ensaios de interação foram aplicadas técnicas de pull-down, SEC-MALS e calorimetria de titulação isotérmica. As proteínas foram produzidas puras e enoveladas, com estado oligomérico determinado como dímero para C-Hsp90 e monômero para Hop e Tom70, sendo que essas também foram encontradas como espécies diméricas. A estequiometria de interação entre a C-Hsp90 e Tom70 foi determinada em 1 monômero da Tom70 para 1 dímero da C-Hsp90, com KD de 360 ± 30 nM, ?Happ = -2,6 ± 0,1 kcal/mol e ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, sugerindo que a interação é dirigida por entalpia e entropia. Os resultados obtidos nesse trabalho contribuem para uma melhor compreensão do sistema Hsp90, que está envolvido em diversos processos celulares essenciais e patológicos, como doenças neurodegenerativas, processos inflamatórios, infecções e câncer / Abstract: The biological function of proteins is related to its three dimensional structure acquired via protein folding process. In this context, the molecular chaperones play a key role acting as auxiliary protein on protein folding, refolding and dissociation of protein aggregates. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, is essential for cell viability in eukaryotes and is usually associated with proteins involved in cell cycling and cell signaling, which makes these chaperone a very interesting targeting for therapeutic approaches for several diseases. The chaperone activity of Hsp90 can be modulated by other proteins, called co-chaperones. In this work, we characterized the protein C-Hsp90 (Cterminal domain of human Hsp90) and the co-chaperones Hop and Tom70, and also the interaction between C-Hsp90 and Tom70. Circular dichroism and fluorescence emission of tryptophan was first applied for initial characterization of the proteins, followed by analytical ultracentrifugation, analytical gel filtration, dynamic light scattering, size exclusion chromatography - multi angle light scattering (SEC-MALS) and native gel. The interaction between C-Hsp90 and Tom70 were measured by techniques like pull-down, SEC-MALS and isothermal titration calorimetry. The proteins were produced pure and soluble and their oligomeric state were determined as dimer for C-Hsp90, and monomer for Hop and Tom70, these two co-chaperones were also found as dimeric species. The stoichiometry of interaction between C-Hsp90 and Tom70 was determined by SEC-MALS and ITC as been 1 dimer of C-Hsp90 to 1 monomer of Tom70, with a KD of 360 ± 30 nM, ?Happ = -2.6 ± 0.1 kcal/mol and ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, suggesting that these interaction is driven by both, enthalpy and entropy. The results contribute to a better understanding of the important Hsp90 machinery, which is involved in many essential cellular and pathological processes, such as neurodegenerative diseases, inflammation, infection and cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular