A leishmaniose é uma enfermidade infecciosa causada por várias espécies de parasitas do gênero Leishmania e representa um dos principais problemas de saúde pública nos países subdesenvolvidos. No hospedeiro, a sobrevivência do protozoário causador dessa doença depende de uma classe especial de proteínas, as chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico como também são conhecidas. A função dessas proteínas é auxiliar no processo de enovelamento protéico, no transporte de proteínas entre as membranas e em muitas outras importantes funções celulares. Neste processo, as chaperonas moleculares são auxiliadas pelas suas co-chaperonas que desempenham função de destaque. Dentre as principais famílias de chaperonas moleculares temos as Hsp70 e as Hsp90 com suas respectivas co-chaperonas, as Hsp40 e a Aha1. O presente trabalho pretendeu inicialmente expressar e purificar as co-chaperonas moleculares Hsp40I e Hsp40II de L. braziliensis para realizar estudos de caracterização estrutural por meio das técnicas de dicroísmo circular e fluorescência. Contudo, a insolubilidade dessas proteínas, que pode ter sido causada pela presença de mutações nas sequências de DNA, motivou a caracterização de outra co-chaperona, a Aha1 de L. braziliensis (LbAha1). A LbAha1 foi expressa no sobrenadante celular e purificada por três etapas cromatográficas (troca aniônica, afinidade por íons cálcio e gel filtração). A análise da sequência de aminoácidos dessa proteína mostra que ela possui 9 resíduos de triptofano distribuídos nos dois domínios característicos da LbAha1. Estudos de desnaturação química por uréia, monitorados pelas técnicas de dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os dois domínios da LbAha1 apresentam estabilidades diferentes. Os estudos estruturais realizados permitiram identificar as transições com o respectivo domínio. / Leishmaniasis is an infectious disease caused by several species of Leishmania species and represents major public health problems in developing countries. In the harborer, the survival of the parasite that cause this disease depends on a special class of proteins, molecular chaperones or heat shock proteins as they are also known. The function of these proteins is to assist in protein folding, transport of proteins and many other important cellular functions. In this process the molecular chaperones are helped by their co-chaperones that play a prominent role. Among the main families of molecular chaperones, there are Hsp70 and Hsp90 with their respective co-chaperones, Hsp40 and the Aha1. The present work, initially pretended to express and purify the molecular co-chaperones Hsp40I and Hsp40II of the L. braziliensis for structural characterization by spectroscopic techniques like fluorescence and circular dichroism. However, the insolubility of these proteins, possibly caused by the presence of mutations in their DNA sequences, led to the characterization of another co-chaperone, the Aha1 of the L. braziliensis. These proteins were expressed in the cell supernatant and purified by three chromatographic steps (anion exchange, affinity for calcium ions and gel filtration). The analysis of the DNA sequence of this protein shows that it has nine Trp residues distributed between the two domains and by urea denaturation studies monitored by fluorescence techniques and circular dichroism show that they have different stabilities.

A leishmaniose é uma enfermidade infecciosa causada por várias espécies de parasitas do gênero Leishmania e representa um dos principais problemas de saúde pública nos países subdesenvolvidos. No hospedeiro, a sobrevivência do protozoário causador dessa doença depende de uma classe especial de proteínas, as chaperonas moleculares ou proteínas de choque térmico como também são conhecidas. A função dessas proteínas é auxiliar no processo de enovelamento protéico, no transporte de proteínas entre as membranas e em muitas outras importantes funções celulares. Neste processo, as chaperonas moleculares são auxiliadas pelas suas co-chaperonas que desempenham função de destaque. Dentre as principais famílias de chaperonas moleculares temos as Hsp70 e as Hsp90 com suas respectivas co-chaperonas, as Hsp40 e a Aha1. O presente trabalho pretendeu inicialmente expressar e purificar as co-chaperonas moleculares Hsp40I e Hsp40II de L. braziliensis para realizar estudos de caracterização estrutural por meio das técnicas de dicroísmo circular e fluorescência. Contudo, a insolubilidade dessas proteínas, que pode ter sido causada pela presença de mutações nas sequências de DNA, motivou a caracterização de outra co-chaperona, a Aha1 de L. braziliensis (LbAha1). A LbAha1 foi expressa no sobrenadante celular e purificada por três etapas cromatográficas (troca aniônica, afinidade por íons cálcio e gel filtração). A análise da sequência de aminoácidos dessa proteína mostra que ela possui 9 resíduos de triptofano distribuídos nos dois domínios característicos da LbAha1. Estudos de desnaturação química por uréia, monitorados pelas técnicas de dicroísmo circular e fluorescência, mostram que os dois domínios da LbAha1 apresentam estabilidades diferentes. Os estudos estruturais realizados permitiram identificar as transições com o respectivo domínio. / Leishmaniasis is an infectious disease caused by several species of Leishmania species and represents major public health problems in developing countries. In the harborer, the survival of the parasite that cause this disease depends on a special class of proteins, molecular chaperones or heat shock proteins as they are also known. The function of these proteins is to assist in protein folding, transport of proteins and many other important cellular functions. In this process the molecular chaperones are helped by their co-chaperones that play a prominent role. Among the main families of molecular chaperones, there are Hsp70 and Hsp90 with their respective co-chaperones, Hsp40 and the Aha1. The present work, initially pretended to express and purify the molecular co-chaperones Hsp40I and Hsp40II of the L. braziliensis for structural characterization by spectroscopic techniques like fluorescence and circular dichroism. However, the insolubility of these proteins, possibly caused by the presence of mutations in their DNA sequences, led to the characterization of another co-chaperone, the Aha1 of the L. braziliensis. These proteins were expressed in the cell supernatant and purified by three chromatographic steps (anion exchange, affinity for calcium ions and gel filtration). The analysis of the DNA sequence of this protein shows that it has nine Trp residues distributed between the two domains and by urea denaturation studies monitored by fluorescence techniques and circular dichroism show that they have different stabilities.

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:37:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gava_LisandraMarques_D.pdf: 9573403 bytes, checksum: 4d69a29d08ffc20e4544b876f131fb0d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A função biológica das proteínas está relacionada à sua estrutura tridimensional adquirida pelo processo de enovelamento protéico. Neste contexto, proteínas denominadas, genericamente, de chaperonas moleculares exercem papel fundamental atuando no auxílio do enovelamento correto, no reenovelamento e na dissociação de agregados protéicos. A Hsp90 é uma das chaperonas moleculares mais importantes, é essencial para a viabilidade celular em eucariotos e está normalmente associada a proteínas atuantes no ciclo e sinalização celular, o que torna essa chaperona um alvo bastante interessante para abordagens terapêuticas de diversas doenças. A Hsp90 pode ser modulada por co-chaperonas diversas. Nesse trabalho foram caracterizadas as proteínas CHsp90 (domínio C-terminal da Hsp90 humana), e as co-chaperonas Hop e Tom70, além da interação entre C-Hsp90 e Tom70. Foram aplicadas técnicas de dicroísmo circular e emissão de fluorescência do triptofano; seguidas pela caracterização por ultracentrifugação analítica, gel filtração analítica, espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de gel filtração acoplada a espalhamento de luz em multi-ângulos (SEC-MALS) e gel nativo. Para os ensaios de interação foram aplicadas técnicas de pull-down, SEC-MALS e calorimetria de titulação isotérmica. As proteínas foram produzidas puras e enoveladas, com estado oligomérico determinado como dímero para C-Hsp90 e monômero para Hop e Tom70, sendo que essas também foram encontradas como espécies diméricas. A estequiometria de interação entre a C-Hsp90 e Tom70 foi determinada em 1 monômero da Tom70 para 1 dímero da C-Hsp90, com KD de 360 ± 30 nM, ?Happ = -2,6 ± 0,1 kcal/mol e ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, sugerindo que a interação é dirigida por entalpia e entropia. Os resultados obtidos nesse trabalho contribuem para uma melhor compreensão do sistema Hsp90, que está envolvido em diversos processos celulares essenciais e patológicos, como doenças neurodegenerativas, processos inflamatórios, infecções e câncer / Abstract: The biological function of proteins is related to its three dimensional structure acquired via protein folding process. In this context, the molecular chaperones play a key role acting as auxiliary protein on protein folding, refolding and dissociation of protein aggregates. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, is essential for cell viability in eukaryotes and is usually associated with proteins involved in cell cycling and cell signaling, which makes these chaperone a very interesting targeting for therapeutic approaches for several diseases. The chaperone activity of Hsp90 can be modulated by other proteins, called co-chaperones. In this work, we characterized the protein C-Hsp90 (Cterminal domain of human Hsp90) and the co-chaperones Hop and Tom70, and also the interaction between C-Hsp90 and Tom70. Circular dichroism and fluorescence emission of tryptophan was first applied for initial characterization of the proteins, followed by analytical ultracentrifugation, analytical gel filtration, dynamic light scattering, size exclusion chromatography - multi angle light scattering (SEC-MALS) and native gel. The interaction between C-Hsp90 and Tom70 were measured by techniques like pull-down, SEC-MALS and isothermal titration calorimetry. The proteins were produced pure and soluble and their oligomeric state were determined as dimer for C-Hsp90, and monomer for Hop and Tom70, these two co-chaperones were also found as dimeric species. The stoichiometry of interaction between C-Hsp90 and Tom70 was determined by SEC-MALS and ITC as been 1 dimer of C-Hsp90 to 1 monomer of Tom70, with a KD of 360 ± 30 nM, ?Happ = -2.6 ± 0.1 kcal/mol and ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, suggesting that these interaction is driven by both, enthalpy and entropy. The results contribute to a better understanding of the important Hsp90 machinery, which is involved in many essential cellular and pathological processes, such as neurodegenerative diseases, inflammation, infection and cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadoesr: Carlos Henrique Inácio Ramos, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_DanieliCristina_M.pdf: 10469841 bytes, checksum: df29d5b11d3cdd27679b971b2bbcb032 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Chaperonas moleculares (Heat Shock proteins - HSPs) são componentes chave do sistema de controle de qualidade de proteínas (PQC - Protein Quality Control), que é essencial para a vida, sendo responsável por manter a homeostase proteica e a adequada função de diversas vias. Problemas no processo de enovelamento estão relacionados a doenças degenerativas, amilóides e câncer. Em plantas, as chaperonas moleculares desempenham um papel crucial na proteção contra estresses bióticos e abióticos, pois como organismos sésseis, as plantas devem ser capazes de responder rapidamente a mudanças na temperatura, salinidade, déficit hídrico, entre outros. A chaperona molecular Hsp90 (Heat Shock protein 90 kDa) compreende uma família ubíqua, considerada um 'hub' por interagir com chaperonas, co-chaperonas e ter como clientes proteínas regulatórias essenciais como fatores de transcrição, quinases, receptores de hormônios, entre outros. A Hsp90 age em conjunto com co-chaperonas, as quais modulam e direcionam sua função. Uma destas co-chaperonas é a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), capaz de interagir simultaneamente com a Hsp90 e Hsp70, mediando a transferência de substratos. A Hop é composta por três domínios com repetições de tetratricopeptídeos (TPR) (TPR1, TPR2A e TPR2B), responsáveis pela interação com as chaperonas, porém a dinâmica desta interação não está bem entendida, uma vez que ainda não há estrutura da Hop inteira e o estado oligomérico desta co-chaperona ainda é controverso na literatura. Neste trabalho apresentamos a classificação de um gene de Hsp90 de cana-de-açúcar, e o início de sua caracterização funcional através de transgenia em Arabidopsis thaliana. Apresentamos também a caracterização biofísica de uma importante co-chaperona da Hsp90, a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein) humana. Através da análise de sequências a Hsp90 de cana-de-açúcar foi classificada como Hsp90-3, uma isoforma citosólica. Plantas transgênicas de A. thaliana, produzidas a partir da inserção do gene da Hsp90-3 de cana-de-açúcar, apresentaram níveis reduzidos de Hsp90. Tal perturbação nos níveis de Hsp90 parece ter afetado a expressão de outras proteínas da rede de interações, relacionadas com processos diversos como resposta imune e fotossíntese. As plantas transgênicas também exibiram germinação mais rápida e raízes mais longas em relação ao controle. Sob estresse térmico, linhagens transgênicas apresentaram maior suscetibilidade à alta temperatura em relação ao controle. Tais resultados sugerem que a Hsp90 tem um importante papel na fisiologia celular e no desenvolvimento, e que os níveis de Hsp90 são críticos para a resposta frente a estresses. A caracterização biofísica do mutante Hop D456G, uma mutação no domínio TPR2B, mostrou que esta proteína é uma mistura de monômeros, dímeros e oligômeros maiores, porém com prevalência do estado monomérico. O resíduo D456 pode ter uma participação na dinâmica de dimerização e é possível que o estado oligomérico da Hop seja regulado entre os estados monomérico e dimérico, com a finalidade de facilitar sua atividade adaptadora / Abstract: Molecular chaperones (heat shock proteins - HSPs) are key components of protein quality-control system (PQC - Protein Quality Control), which maintains protein homeostasis and the proper function of several pathways, being essential for life. Defects in folding processes are related to degenerative diseases, amyloidosis and cancer. In plants, which as sessile organisms must be able to respond rapidly to changes in temperature, salinity, water deficit, and others, molecular chaperones play a crucial role in protecting against such biotic and abiotic stresses. Molecular chaperone Hsp90 (Heat Shock Protein 90 kDa) comprise an ubiquitous family, considered a hub as it interacts with chaperones, co-chaperones, and have as clients key regulatory proteins such as transcription factors, kinases, hormone receptors, and others. The chaperone acts together with co-chaperones, which modulate and guide Hsp90 function. The co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), interacts simultaneously with Hsp90 and Hsp70, mediating substrate transfer. Hop has three TPR domains (TPR1, and TPR2A TPR2B) responsible for interaction with the chaperones, but this interaction dynamics remains unclear, since there is no structure of full length Hop and its oligomeric state is controversial in literature reports. This work presents the classification of an Hsp90 gene from sugarcane, and primary functional characterization studies in Arabidopsis thaliana transgenic lines. We also present the biophysical characterization of the human Hsp90 co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein). Through sequence analysis the Hsp90 from sugarcane has been classified as Hsp90-3, a cytosolic isoform. Transgenic A. thaliana, produced by Hsp90-3 insertion, exhibited reduced transcript levels of Hsp90. This disruption in Hsp90 levels seems to affect the expression of other proteins from the interaction network, which are related to various processes such as immune response and photosynthesis. Transgenics also exhibited faster germination and longer roots than the control. Under heat stress, transgenic lines showed increased susceptibility to high temperature. These results suggest that Hsp90 has an important role in cellular physiology and development; in addition the levels of Hsp90 are critical for responses to stresses. The biophysical characterization of the mutant D456G Hop, a mutation in domain TPR2B showed that this protein is a mixture of monomers, dimers and higher oligomers, but the monomeric state is majoritary. The residue D456 may be involved in dimerization dynamics, and it is possible that Hop is regulated between monomeric and dimeric species, to enable its adaptor functions / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular