As chaperonas moleculares são proteínas que auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células, motivo pelo qual elas têm sido alvo para o combate de várias doenças. As Hsp90 (82-96 kDa) são chaperonas abundantes que interagem com diversas proteínas-cliente. São constituídas por três domínios: N-terminal, intermediário ou central (M) e C-terminal, o qual é responsável pela dimerização da proteína. A atividade da Hsp90 está diretamente relacionada à sua atividade ATPásica. Durante o ciclo funcional, as Hsp90 podem interagir com inúmeras co-chaperonas. Uma delas é a co-chaperona p23 (18-22 kDa) que interage com o dímero da Hsp90 e algumas das suas funções são a inibição da atividade ATPásica e atividade chaperona. O objetivo do trabalho foi obter a proteína recombinante Hsp90 de Leishmania braziliensis e os domínios N e N+M, determinar fatores importantes que relacionam mudanças conformacionais e função da Hsp90 e as bases moleculares da inibição por GA. Também obter as co-chaperonas Lbp23A e Lbp23B e investigar a interação com a LbHsp90 e suas funções. As proteínas produzidas foram purificadas e caracterizadas por técnicas biofísicas. Em solução, a LbHsp90 foi caracterizada como dímero assimétrico e as demais proteínas como monômeros assimétricos.A interação da LbHsp90 e domínios com nucleotídeos foi analisada por fluorescência e as constantes de dissociação ficaram em torno de 150 µM. A afinidade por GA foi maior que a verificada para ATP e em ordem crescente para LbHsp90, LbHsp90_NM e LbHsp90_N. A LbHsp90 apresentou grande atividade chaperona em relação à citrato sintase, de maneira independente de ATP. A LbHsp90 mostrou baixa atividade ATPásica, a qual foi inibida pela GA com IC50 de 0,7 µM. Tanto a Lbp23A quanto a Lbp23B inibiram a atividade ATPásica da LbHsp90, porém a Lbp23A aproximou-se de 100% de inibição e a Lbp23B apenas 30%. A interação in vitro entre a LbHsp90 e a Lbp23B foi observada por pull-down na presença/ausência de nucleotídeos e essa técnica não se mostrou adequada para a Lbp23A.O pioneirismo do trabalho com a Hsp90/p23 de L. braziliensis oferece uma grande contribuição para futuros trabalhos que visam o entendimento das relações funcionais entre essas proteínas e o contexto das Hsp90 no desenvolvimento da leishmaniose. / Molecular chaperones are proteins involved in proper folding of other proteins, and others important cellular functions, why they have been targeted for combating various diseases. The Hsp90 (82-96 kDa) are ubiquitous chaperones that interact with a wide range of client proteins. They are formed by three domains: N-terminal, central or middle (M), and C-terminal, which is responsible by its dimerization. The Hsp90 activity is related to its ATPase activity. During the Hsp90 functional cycle, diverse co-chaperones. One of them is the p23 (18 kDa), that interacts with one Hsp90 dimer, and some p23 functions are the inhibition of Hsp90 ATPase activity and chaperone activity. The aim of this work was obtain the Hsp90 recombinant Leishmania braziliensis Hsp90, the N and N+M domains, to determine the important factors related to conformational changes and Hsp90 function, and the molecular basis of GA inhibition. Also, to obtain the Lbp23A and Lbp23B co-chaperones in order to establish relevant aspects for LbHsp90 interaction and its co-chaperones functions. The recombinant proteins were produced, purified and characterized by biophysics techniques. The LbHsp90 was identified as an asymmetric dimer for whereas the others were identified as asymmetric monomers. The interactions between LbHsp90 and domains with nucleotides were determined by fluorescence and the dissociation constants were about 150 µM. The GA-affinity was greater than ATP one, in increasing order for LbHsp90, LbHsp90_NM, and LbHsp90_N. The LbHsp90 showed large chaperone activity related to citrate synthase independently of ATP. The LbHsp90 presented low ATPase activity, which was inhibited by GA with a IC50 of 0,7. The Lbp23A and Lbp23B inhibited the ATPase activity with different values, the Lbp23A inhibition was closed to 100% whereas the Lbp23B one was 30%. The in vitro interaction between the LbHsp90 and Lbp23B was observed by pull-down, in the absence or presence of nucleotides, and for Lbp23A this technique was not appropriated. The pioneering work with Hsp90/p23 from L. braziliensis offers an important contribution to future studies aimed at understanding the functional relationships between these proteins and the context of Hsp90 in the development of leishmaniasis.

As chaperonas moleculares são ativas em muitos processos celulares envolvendo o enovelamento e a homeostase de proteínas. Essas características fazem das chaperonas alvos potenciais para o tratamento de diversas doenças. As Hsp70 e as Hsp90, em especial, são proteínas ubíquas altamente conservadas biologicamente que atuam no enovelamento de proteínas nascentes, prevenção da agregação proteica, recuperação de proteínas de agregados, sinalização e crescimento celular, dentre outros. Contudo, para que essas proteínas cumpram eficientemente suas funções, elas devem ser moduladas por co-chaperonas moleculares. A SGT é uma co-chaperona que pode ser dividida em três regiões: domínio N-terminal, domínio TPR e domínio C-terminal, sendo que a região do domínio TPR é a responsável pela interação com o motivo EEVD no C-terminal das Hsp90 e Hsp70 citoplasmáticas. A SGT é encontrada em vários organismos, dentre eles os protozoários do gênero Leishmania spp.. Estes organismos são responsáveis pela leishmaniose, uma doença negligenciada que afeta milhares de pessoas todos os anos, principalmente em países subdesenvolvidos. Evidências indicam que a SGT em protozoários é essencial para o crescimento e viabilidade da forma promastigota. Diante disso, nesse trabalho foi feito o estudo estrutural e funcional da co-chaperona SGT de Leishmania braziliensis (LbSGT). A LbSGT recombinante foi produzida e purificada. A caracterização estrutural indica que a LbSGT é uma proteína rica em estrutura secundária do tipo hélice α que se comporta como um dímero alongado em solução. Dados de estabilidade térmica e química indicam que a LbSGT é uma proteína formada por domínios com diferentes estabilidades. A LbSGT foi identificada in vivo e o western blotting indicou sua presença cognata nas formas promastigotas do protozoário. Os ensaios de interação indicam que as interações entre a LbSGT e a Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e a LbSGT e Hsp70-1A humana (usada como proteína modelo) são diferentes da interação da LbSGT com o peptídeo MEEVD. Sendo assim, esses dados sugerem que a interação da LbSGT com a Hsp70-1A e LbHsp90 envolvem mais regiões das proteínas do que somente o motivo de interação da Hsp70-1A e da LbHsp90 com o domínio TPR da LbSGT. Em conjunto, as propriedades estruturais e funcionais da LbSGT observadas estão de acordo com a possível função da SGT como proteína adaptadora entre os sistemas Hsp70 e Hsp90 no foldossoma. / The molecular chaperones are active in many cellular processes involving protein folding and homeostasis. These characteristics make the chaperones potential targets to the treatment of many diseases. Hsp70 and Hsp90, in special, are highly conserved ubiquitous proteins that act in the folding of nascent proteins, protein aggregation prevention, aggregate recovering, signaling and cellular growth, among others. However, for these proteins to effectively fulfill their function, they must be modulated by molecular co-chaperones. SGT is a co-chaperone that can be divided into three domains: a N-terminal domain, a TPR domain and a C-terminal domain, being the TPR domain responsible for the interaction with the EEVD motif at the C-terminus of cytoplasmic Hsp90 and Hsp70. SGT is found in various organisms; among they are the protozoans of Leishmania spp.. These organisms are responsible for leishmaniasis, a neglected disease that affects thousands people every year, mainly at underdeveloped countries. Evidences indicate that SGT in protozoans are essential to the growth and viability of promastigote form. Therefore, the structural and functional study of the Leishmania braziliensis SGT (LbSGT) is presented. Recombinant LbSGT was produced and purified. The structural characterization points that LbSGT is rich in α-helix secondary structure and behaves as an elongated dimer in solution. Chemical and thermal stability data suggest that LbSGT is formed by domains of different stabilities. LbSGT was identified in vivo and the western blotting indicates its cognate presence in the protozoan promastigote forms. The interaction assays show that the interaction between LbSGT and Hsp90 of L. braziliensis (LbHsp90) or human Hsp70-1A (used as model protein) were different from the interaction between LbSGT with MEEVD peptide. Moreover, these data suggests that the interaction between LbSGT and Hsp70-1A and LbHsp90 involves additional protein regions besides the Hsp70-1A and LbHsp90 interaction motif. Altogether, the observed functional and structural proprieties of LbSGT accord to the SGT possible function as an adapter protein between the Hsp70 and Hsp90 systems in the foldossome.

As chaperonas moleculares são ativas em muitos processos celulares envolvendo o enovelamento e a homeostase de proteínas. Essas características fazem das chaperonas alvos potenciais para o tratamento de diversas doenças. As Hsp70 e as Hsp90, em especial, são proteínas ubíquas altamente conservadas biologicamente que atuam no enovelamento de proteínas nascentes, prevenção da agregação proteica, recuperação de proteínas de agregados, sinalização e crescimento celular, dentre outros. Contudo, para que essas proteínas cumpram eficientemente suas funções, elas devem ser moduladas por co-chaperonas moleculares. A SGT é uma co-chaperona que pode ser dividida em três regiões: domínio N-terminal, domínio TPR e domínio C-terminal, sendo que a região do domínio TPR é a responsável pela interação com o motivo EEVD no C-terminal das Hsp90 e Hsp70 citoplasmáticas. A SGT é encontrada em vários organismos, dentre eles os protozoários do gênero Leishmania spp.. Estes organismos são responsáveis pela leishmaniose, uma doença negligenciada que afeta milhares de pessoas todos os anos, principalmente em países subdesenvolvidos. Evidências indicam que a SGT em protozoários é essencial para o crescimento e viabilidade da forma promastigota. Diante disso, nesse trabalho foi feito o estudo estrutural e funcional da co-chaperona SGT de Leishmania braziliensis (LbSGT). A LbSGT recombinante foi produzida e purificada. A caracterização estrutural indica que a LbSGT é uma proteína rica em estrutura secundária do tipo hélice α que se comporta como um dímero alongado em solução. Dados de estabilidade térmica e química indicam que a LbSGT é uma proteína formada por domínios com diferentes estabilidades. A LbSGT foi identificada in vivo e o western blotting indicou sua presença cognata nas formas promastigotas do protozoário. Os ensaios de interação indicam que as interações entre a LbSGT e a Hsp90 de L. braziliensis (LbHsp90) e a LbSGT e Hsp70-1A humana (usada como proteína modelo) são diferentes da interação da LbSGT com o peptídeo MEEVD. Sendo assim, esses dados sugerem que a interação da LbSGT com a Hsp70-1A e LbHsp90 envolvem mais regiões das proteínas do que somente o motivo de interação da Hsp70-1A e da LbHsp90 com o domínio TPR da LbSGT. Em conjunto, as propriedades estruturais e funcionais da LbSGT observadas estão de acordo com a possível função da SGT como proteína adaptadora entre os sistemas Hsp70 e Hsp90 no foldossoma. / The molecular chaperones are active in many cellular processes involving protein folding and homeostasis. These characteristics make the chaperones potential targets to the treatment of many diseases. Hsp70 and Hsp90, in special, are highly conserved ubiquitous proteins that act in the folding of nascent proteins, protein aggregation prevention, aggregate recovering, signaling and cellular growth, among others. However, for these proteins to effectively fulfill their function, they must be modulated by molecular co-chaperones. SGT is a co-chaperone that can be divided into three domains: a N-terminal domain, a TPR domain and a C-terminal domain, being the TPR domain responsible for the interaction with the EEVD motif at the C-terminus of cytoplasmic Hsp90 and Hsp70. SGT is found in various organisms; among they are the protozoans of Leishmania spp.. These organisms are responsible for leishmaniasis, a neglected disease that affects thousands people every year, mainly at underdeveloped countries. Evidences indicate that SGT in protozoans are essential to the growth and viability of promastigote form. Therefore, the structural and functional study of the Leishmania braziliensis SGT (LbSGT) is presented. Recombinant LbSGT was produced and purified. The structural characterization points that LbSGT is rich in α-helix secondary structure and behaves as an elongated dimer in solution. Chemical and thermal stability data suggest that LbSGT is formed by domains of different stabilities. LbSGT was identified in vivo and the western blotting indicates its cognate presence in the protozoan promastigote forms. The interaction assays show that the interaction between LbSGT and Hsp90 of L. braziliensis (LbHsp90) or human Hsp70-1A (used as model protein) were different from the interaction between LbSGT with MEEVD peptide. Moreover, these data suggests that the interaction between LbSGT and Hsp70-1A and LbHsp90 involves additional protein regions besides the Hsp70-1A and LbHsp90 interaction motif. Altogether, the observed functional and structural proprieties of LbSGT accord to the SGT possible function as an adapter protein between the Hsp70 and Hsp90 systems in the foldossome.

As chaperonas moleculares são proteínas que auxiliam no enovelamento correto de outras proteínas, entre outras funções importantes para as células, motivo pelo qual elas têm sido alvo para o combate de várias doenças. As Hsp90 (82-96 kDa) são chaperonas abundantes que interagem com diversas proteínas-cliente. São constituídas por três domínios: N-terminal, intermediário ou central (M) e C-terminal, o qual é responsável pela dimerização da proteína. A atividade da Hsp90 está diretamente relacionada à sua atividade ATPásica. Durante o ciclo funcional, as Hsp90 podem interagir com inúmeras co-chaperonas. Uma delas é a co-chaperona p23 (18-22 kDa) que interage com o dímero da Hsp90 e algumas das suas funções são a inibição da atividade ATPásica e atividade chaperona. O objetivo do trabalho foi obter a proteína recombinante Hsp90 de Leishmania braziliensis e os domínios N e N+M, determinar fatores importantes que relacionam mudanças conformacionais e função da Hsp90 e as bases moleculares da inibição por GA. Também obter as co-chaperonas Lbp23A e Lbp23B e investigar a interação com a LbHsp90 e suas funções. As proteínas produzidas foram purificadas e caracterizadas por técnicas biofísicas. Em solução, a LbHsp90 foi caracterizada como dímero assimétrico e as demais proteínas como monômeros assimétricos.A interação da LbHsp90 e domínios com nucleotídeos foi analisada por fluorescência e as constantes de dissociação ficaram em torno de 150 µM. A afinidade por GA foi maior que a verificada para ATP e em ordem crescente para LbHsp90, LbHsp90_NM e LbHsp90_N. A LbHsp90 apresentou grande atividade chaperona em relação à citrato sintase, de maneira independente de ATP. A LbHsp90 mostrou baixa atividade ATPásica, a qual foi inibida pela GA com IC50 de 0,7 µM. Tanto a Lbp23A quanto a Lbp23B inibiram a atividade ATPásica da LbHsp90, porém a Lbp23A aproximou-se de 100% de inibição e a Lbp23B apenas 30%. A interação in vitro entre a LbHsp90 e a Lbp23B foi observada por pull-down na presença/ausência de nucleotídeos e essa técnica não se mostrou adequada para a Lbp23A.O pioneirismo do trabalho com a Hsp90/p23 de L. braziliensis oferece uma grande contribuição para futuros trabalhos que visam o entendimento das relações funcionais entre essas proteínas e o contexto das Hsp90 no desenvolvimento da leishmaniose. / Molecular chaperones are proteins involved in proper folding of other proteins, and others important cellular functions, why they have been targeted for combating various diseases. The Hsp90 (82-96 kDa) are ubiquitous chaperones that interact with a wide range of client proteins. They are formed by three domains: N-terminal, central or middle (M), and C-terminal, which is responsible by its dimerization. The Hsp90 activity is related to its ATPase activity. During the Hsp90 functional cycle, diverse co-chaperones. One of them is the p23 (18 kDa), that interacts with one Hsp90 dimer, and some p23 functions are the inhibition of Hsp90 ATPase activity and chaperone activity. The aim of this work was obtain the Hsp90 recombinant Leishmania braziliensis Hsp90, the N and N+M domains, to determine the important factors related to conformational changes and Hsp90 function, and the molecular basis of GA inhibition. Also, to obtain the Lbp23A and Lbp23B co-chaperones in order to establish relevant aspects for LbHsp90 interaction and its co-chaperones functions. The recombinant proteins were produced, purified and characterized by biophysics techniques. The LbHsp90 was identified as an asymmetric dimer for whereas the others were identified as asymmetric monomers. The interactions between LbHsp90 and domains with nucleotides were determined by fluorescence and the dissociation constants were about 150 µM. The GA-affinity was greater than ATP one, in increasing order for LbHsp90, LbHsp90_NM, and LbHsp90_N. The LbHsp90 showed large chaperone activity related to citrate synthase independently of ATP. The LbHsp90 presented low ATPase activity, which was inhibited by GA with a IC50 of 0,7. The Lbp23A and Lbp23B inhibited the ATPase activity with different values, the Lbp23A inhibition was closed to 100% whereas the Lbp23B one was 30%. The in vitro interaction between the LbHsp90 and Lbp23B was observed by pull-down, in the absence or presence of nucleotides, and for Lbp23A this technique was not appropriated. The pioneering work with Hsp90/p23 from L. braziliensis offers an important contribution to future studies aimed at understanding the functional relationships between these proteins and the context of Hsp90 in the development of leishmaniasis.

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T21:47:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Seraphim_ThiagoVargas_M.pdf: 4293116 bytes, checksum: bd401fff62b6ce29029ac35de3bc753a (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O enovelamento protéico é essencial para a correta função biológica das proteínas. A existência de um ambiente com alta concentração dos mais diferentes tipos de moléculas, dentro da célula, e de diversos tipos de situações de estresse, podem agir induzindo a formação de espécies improdutivas na via de enovelamento, como proteínas mal enoveladas e/ou até mesmo agregados protéicos. Para controlar estes eventos, há a maquinaria de chaperonas moleculares, que tem por objetivo garantir a homeostase protéica celular. As chaperonas moleculares são capazes de ligar e estabilizar um polipeptídio, mas sem contribuir com informações para a sua conformação final. Dentro desta maquinaria, o sistema Hsp70 tem um papel central, sendo responsável por receber proteínas desenoveladas ou mal enoveladas de outras chaperonas, podendo auxiliar no reenovelamento e direcionamento para outras chaperonas moleculares ou para degradação. A Hsp70 é regulada por co-chaperonas, como a Hsp40, que é responsável pela entrega de proteínas clientes à Hsp70 e pelo estímulo da atividade ATPase, essencial para a funcionalidade da Hsp70. Este trabalho apresenta a caracterização de uma Hsp40 tipo I de cana-de-açúcar, nomeada SHsp40, e o estudo de uma Hsp40 tipo II de levedura e seus mutantes, a fim de entender a relação estrutura-função destas proteínas. A SHsp40 foi expressa em E. coli, purificada e obtida enovelada, como verificado por dicroísmo circular. Além disso, a SHsp40 apresentou atividade chaperona em experimentos de proteção ao substrato desenovelado e se comportou como um dímero alongado em solução, como mostrado por SEC-MALS e pela determinação do fator de Perrin. Experimentos de desenovelamento térmico monitorado pelo sinal de CD a 222 nm revelaram que a SHsp40 possui pelo menos um intermediário, e a fluorescência de tioflavina T e bis-ANS mostraram que este intermediário é rico em folhas ? e parcialmente desenovelado, características de espécies na via de formação de fibrilas. A SHsp40 agregada foi examinada por microscopia eletrônica de varredura, que comprovou sua capacidade de formar de fibrilas. Este trabalho também contribuiu para o estudo de uma Hsp40 tipo II de levedura, Sis1, e seus mutantes de deleção, Sis1?124-174 e Sis1?121-257. Ensaios de fluorescência estática do triptofano, fotoapagamento e anisotropia mostraram que a deleção do domínio G/M não afetou a estrutura e hidrodinâmica de Sis1?124-174 em relação à proteína selvagem. Estudos de estabilidade destas proteínas, realizado anteriormente em nosso grupo de pesquisa e complementado neste trabalho pelo uso da técnica de SEC-MALS, mostrou que Sis1 e Sis1?124-174 foram mais estáveis que Sis1?121-257, mutante que o domínio G/M e subdomínio CTDI estão ausentes / Abstract: Correct protein folding is essential for proper protein biological function. There is a crowded environment and many types of molecules inside the cell and a variety of external stresses can act inducing unproductive species, as unfolded and/or misfolded proteins and even protein aggregates. To control these undesired events and ensures the protein homeostasis there is a molecular chaperone machinery. Molecular chaperones are able to bind and stabilize polypeptides but with no contributions for their final conformations. Inside this machinery, the Hsp70 system has a central role and is responsible to receive unfolded or misfolded proteins from other chaperones, helping in protein refolding and delivering the clients to other chaperones and even protein targeting for degradation. Hsp70 is regulated by its co-chaperones, such as Hsp40, which is responsible to client proteins deliver to Hsp70 and stimulation of its ATPase activity, essential processes for Hsp70 function. This work presents a sugarcane type I Hsp40 characterization, named SHsp40, and studies of an yeast type II Hsp40 and its mutants in order to understand the structure-function relationship of these proteins. The SHsp40 was expressed in E. coli, purified and obtained folded, as verified by circular dichroism. Furthermore, SHsp40 presented chaperone activity in unfolded substrate protection experiments and behaved as an elongated dimer in solution, as shown by SEC-MALS and estimated by Perrin factor. Thermal-induced unfolding experiments monitored by CD signal at 222 nm revealed that SHsp40 has at least one intermediate which is populated and tioflavin T and bis-ANS fluorescence showed that this intermediate is ? sheet-rich and partially folded, such as intermediate species in the fibril formation pathway. The aggregated SHsp40 was examined by scanning electron microscopy, wich proved its ability to fibril formation. This work also contributed for the study of an yeast type II Hsp40, Sis1, and its deletion mutants, Sis1?124-174 and Sis1?121-257. Steady-state tryptophan fluorescence, quenching and anisotropy assays showed that the G/M domain deletion did not affect the structure and hydrodynamic properties of Sis1?124-174 in relation to the wild type protein. Stability studies of these proteins, previously performed in our research group and complemented in this work by using the SEC-MALS technique, showed that Sis1 and Sis1?124-174 were more stable than Sis1?121-257, a mutant with the G/M domain and CTDI subdomain absents / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

As chaperonas moleculares atuam no enovelamento de proteínas, montagem de complexos, prevenção/recuperação de proteínas de agregados e encaminhamento de proteínas mal enoveladas para depuração. As Hsp90 são chaperonas moleculares que atuam estabilizando proteínas relacionadas a vias de sinalização, crescimento celular, processos transcricionais e traducionais, estabilidade do genoma, entre outras, sendo essencial para a viabilidade celular. Em protozoários do gênero Leishmania, as Hsp90 são imprescindíveis no desenvolvimento, adaptação e transformação celular. Estes fatores fazem das Hsp90 alvos potenciais para o tratamento de patologias, como a leishmaniose, uma doença tropical negligenciada. As Hsp90 são homodímeros flexíveis onde cada protômero é dividido em três domínios denominados N, M e C. As Hsp90 possuem um ciclo conformacional associado ao seu ciclo funcional e sua baixa atividade ATPásica, o qual é direcionado e regulado por proteínas auxiliares, as co-chaperonas. A co-chaperona Aha1 atua estimulando a atividade ATPásica da Hsp90, participando da maturação de proteínas quinase e receptores de hormônios. O objetivo deste trabalho foi caracterizar estruturalmente a proteína Aha1 de L. braziliensis (LbAha1) e seu mecanismo de interação com a Hsp90 desse organismo (LbHsp90). A LbAha1 é formada por dois domínios, LbAha1N e LbAha1C, conectados entre si por um linker flexível. Experimentos de identificação in vivo mostraram que a LbAha1 e LbHsp90 são proteínas cognatas. A LbAha1 e as construções de seus domínios (LbAha1N e LbAha1C) recombinantes foram obtidas puras e enoveladas. A LbAha1 é estruturada em dois domínios com diferentes estabilidades, que não interagem entre si e se enovelam independentemente, porém influenciam-se reciprocamente. Em solução, a LbAha1 se comporta como um monômero alongado e possui notável flexibilidade, com dimensão suficiente para interagir com os domínios N e M da LbHsp90. A análise da interação entre a LbAha1 e LbHsp90 revelou que a associação destas proteínas é dirigida entalpicamente, ocorrendo através de interações eletrostáticas e com estequiometria de 2 moléculas de LbAha1 por dímero de LbHsp90. O mapeamento de regiões envolvidas na interação indicou que o domínio LbAha1N e o domínio M da LbHsp90 compõem o cerne da interação e somente a LbAha1 íntegra é capaz de encaminhar a LbHsp90 para um estado fechado. Experimentos de cinética enzimática mostraram que somente a LbAha1 íntegra estimula a atividade ATPásica da LbHsp90 por meio de um mecanismo cooperativo positivo. Assim, é proposto que a conexão entre os domínios da LbAha1, via linker, é essencial para o direcionamento da LbHsp90 para um estado conformacional fechado e competente na hidrólise de ATP. / Molecular chaperones play a role in protein folding, complex assembly, prevention/recover of proteins from aggregates and targeting misfolded proteins to depuration. Hsp90 molecular chaperones work stabilizing proteins related to signaling pathways, cell growth, transcription and translation processes, genome stability, among others, and are essential to cell viability. In protozoa of the genus Leishmania, Hsp90s are indispensable for cell developing, adaptation and transformation. These factors make Hsp90s potential targets for pathologies treatment, such as leishmaniasis, a neglected tropical disease. Hsp90s are flexible homodimers and each protomer is divided into three domains named N, M and C. Hsp90s have a conformational cycle associated to its functional cycle and low ATPase activity, which is directed and regulated by auxiliary proteins, so-called cochaperones. Aha1 co-chaperone stimulates Hsp90 ATPase activity, participating on protein kinase and hormone receptors maturation. This work aimed to characterize the structure of the Aha1 from L. braziliensis (LbAha1) and its mechanism of interaction with the Hsp90 from the same organism (LbHsp90). LbAha1 is formed by two domains, LbAha1N and LbAha1C, connected to each other by a flexible linker. In vivo experiments identified LbAha1 and LbHsp90 as cognate proteins. Recombinant LbAha1 and its domains construct (LbAha1N and LbAha1C) were obtained pure and folded. LbAha1 is divided into two domains with dissimilar stabilities and they do not interact to each other. In spite of this they fold independently and influence each other reciprocally. LbAha1 behaves as an elongated monomer in solution and has a remarkable flexibility, with sufficient dimension to interact to LbHsp90 N and M domains. The analysis of the LbAha1-LbHsp90 interaction revealed that the association between these two proteins is enthalpically driven, occurring through electrostatic interactions in a stoichiometry of 2 LbAha1 molecules per LbHsp90 dimer. Domain mapping experiments indicated that LbAha1N and LbHsp90 M domains compose the core of the interaction and only full length LbAha1 is able to direct LbHsp90 toward a closed state. Enzyme kinetics experiments showed that only full length LbAha1 stimulates LbHsp90 ATPase activity through a positive cooperative mechanism. Thus, it is proposed that the connection between the LbAha1 domains, via linker, is essential to direct the LbHsp90 toward a closed and ATPase-competent conformational state.

O período de puberdade, em equinos, define-se pela aparição de espermatozóides maduros no ejaculado de animais jovens, bem como a maturação das funções endócrinas. Os espermatozóides precisam passar por um processo de maturação no epidídimo. Para se obter marcadores moleculares que permitam estabelecer a fertilidade de um garanhão, é necessário um melhor conhecimento das proteínas presentes em espermatozóides imaturos e maduros, uma das quais é a PDI (proteína dissulfeto-isomerase). A PDI foi descrita também como importante marcador de fertilidade no plasma seminal e espermatozóides de diversas espécies. O objetivo deste trabalho foi identificar a presença da PDI no epidídimo equino durante a puberdade, e quantificá-la no fluido e espermatozóides epididimários. Visou verificar a presença da PDI no plasma seminal e espermatozóides ejaculados, em garanhões férteis e subférteis. Foram realizados dois experimentos: Experimento 1: utilizou-se 22 equinos Crioulos saudáveis, castrados e divididos em três grupos: G1: potros até 24 meses, G2: de 25-36 meses e G3: a partir de 36 meses. Imediatamente após a castração, foi efetuada a dissecação do epidídimo para a coleta de fluido epididimário, o qual foi separado dos espermatozoides por centrifugação a 800 g por 10minutos. O sobrenadante foi removido, e criopreservado a -196º C. Os espermatozóides foram ressuspendidos em PBS e armazenados a -196º C. Para a dosagem de proteína das amostras, utilizou-se o método de Kit BCA espectrofotômetro e a eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% SDS- Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Para a visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas quantificadas pela utilização do software livre ImageJ. A PDI foi identificada nos três grupos avaliados na análise proteômica do fluido , e espermatozoides epididimários, sendo sua quantidade inferior no G1 em relação aos grupos dois (2) e três (3). Em conclusão, a expressão da PDI nos espermatozóides e fluido epididimários de potros castrados cirurgicamente, aumenta conforme o animal atinge a maturidade sexual. Experimento 2- Utilizou-se 12 garanhões adultos que já haviam sido submetidos à pelo menos duas temporadas de monta na região da Campanha do Rio Grande do Sul, efetuando-se quatro (4) coletas de cada garanhão, fora da estação de monta, respeitando-se um intervalo de 48h entre coletas. Imediatamente após a coleta, analisou-se motilidade, vigor e concentração com auxílio de microscópio óptico e retirou-se uma alíquota de sêmen para avaliação das patologias espermáticas. A partir dos dados obtidos, os garanhões foram divididos em dois grupos: Grupo 1: motilidade não inferior a 70%, tendo-se uma média de 76,04±5,89% e histórico reprodutivo de temporadas anteriores com índice de prenhez mínimo por temporada de 80%. Grupo 2: motilidade igual ou inferior a 30%, com média de 11,83±11,21%, e histórico reprodutivo de temporadas anteriores de índices de prenhez inferiores a 35%. Efetuadas as análises, as mostras foram centrifugadas a 800 g por 10 minutos para separar o plasma seminal, de mesma forma que no Exp. 1. Os pellets passaram por ressuspensão em PBS gelado e posteriormente armazenados a -196º C. As amostras foram submetidas à dosagem das proteínas, para serem submetidas à eletroforese, utilizando-se géis de poliacrilamida a 10% SDS-Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Na visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas foram quantificadas pela utilização do software livre Image J. Ao analisar a presença da PDI no plasma seminal dos garanhões, verificou-se sua expressão em ambos os grupos; porém não houve diferença de expressão da PDI entre eles(p˂0,05). Não houve também relação da PDI com motilidade, nem com a concentração espermática. Considerando os dados obtidos no presente experimento, não foi possível relacionar a PDI com qualidade espermática e assim considerá-la como um potencial marcador de fertilidade em equinos. São necessários mais estudos que possam envolver outros fatores moleculares inclusive as demais proteínas da família das PDIs. / Puberty, in the equine species, may be defined by the appearance of mature spermatozoa in young animals´ ejaculates, as well as endocrine function maturation. One of the proteins found in immature and mature spermatozoa is PDI (protein dissulfide-isomerase). PDI was also described as an important fertility marker both in seminal plasma and sperm of many species. is responsible for rearranging dissulfide bonds, necessary for sperm adhesion proteins to link to the oocyte. The aim of this work was to identify PDI in equine epididymis during puberty, and quantify it in epididymal sperm and fluid of fertile and subfertile sperm. Two experiments were performed. Experiment 1-twenty-two healthy Crioulo colts were surgically castrated, and divided in three groups: G1: until 24 months; G2: from 25-36 months and G3: more than 36 months. Immediately after castration, testicles were measured, weighed, and the epididymis was dissecated for epididymal fluid collection, which was centrifuged at 800 g for 10minutes to separate epididymal fluid from sperm. Supernatant was removed, and cryopreserved at -196º C. Sperm were re-suspended in PBS and stored at -196º C. Protein dosing of samples was performed with BCA Kit and electrophoresis at 10% SDS-Page. To detect proteins, primary antibody was incubated for at least 6 hours at 4º C, and then incubation with secondary antibody conjugated with anti-mouse IgG or anti-rat IgG. To see bands, ECL Kit in X-ray films was used, and the bands quantified with softwareImageJ. In the three groups PDI was identified, in epididymal fluid and epididymal sperm, but in smaller amount in G1 when compared with Groups 2 and 3. In conclusion, expression of PDI in epididymal fluid and sperm of surgically castrated colts, increases as the animal attains sexual maturity. Experiment 2- The aim of this work was to verify the presence of PDI in equine seminal plasma and sperm, quantify it and to compare its expression on seminal plasma from fertile and subfertile stallions. Twelve adult stallions with at least two breeding season were used. For the study, four collections of each animal were performed. Immediately after collection, analysis of motility, velocity, concentration and sperm morphology were performed. Stallions were divided in two groups, according to the semen analysis and previous breeding history: Group 1: motility greater than 70% and previous history of pregnancy rates higher than 80%; Group 2: sperm motility less or equal than 30% and breeding history of less than 35% of pregnacy per season. After the analysis, samples were centrifuged at 800 g/10minutes to remove seminal plasma. Samples were prepared as described in Exp. 1. The expression of PDI in seminal plasma was seen in both groups, but with no statistical difference between them. There was no correlation of PDI with sperm motility or concentration. According to these findings, it is not possible to consider PDI as a fertility marker in stallions. More research is needed, involving other mollecular factors, including other PDIs family proteins.

As chaperonas moleculares atuam no enovelamento de proteínas, montagem de complexos, prevenção/recuperação de proteínas de agregados e encaminhamento de proteínas mal enoveladas para depuração. As Hsp90 são chaperonas moleculares que atuam estabilizando proteínas relacionadas a vias de sinalização, crescimento celular, processos transcricionais e traducionais, estabilidade do genoma, entre outras, sendo essencial para a viabilidade celular. Em protozoários do gênero Leishmania, as Hsp90 são imprescindíveis no desenvolvimento, adaptação e transformação celular. Estes fatores fazem das Hsp90 alvos potenciais para o tratamento de patologias, como a leishmaniose, uma doença tropical negligenciada. As Hsp90 são homodímeros flexíveis onde cada protômero é dividido em três domínios denominados N, M e C. As Hsp90 possuem um ciclo conformacional associado ao seu ciclo funcional e sua baixa atividade ATPásica, o qual é direcionado e regulado por proteínas auxiliares, as co-chaperonas. A co-chaperona Aha1 atua estimulando a atividade ATPásica da Hsp90, participando da maturação de proteínas quinase e receptores de hormônios. O objetivo deste trabalho foi caracterizar estruturalmente a proteína Aha1 de L. braziliensis (LbAha1) e seu mecanismo de interação com a Hsp90 desse organismo (LbHsp90). A LbAha1 é formada por dois domínios, LbAha1N e LbAha1C, conectados entre si por um linker flexível. Experimentos de identificação in vivo mostraram que a LbAha1 e LbHsp90 são proteínas cognatas. A LbAha1 e as construções de seus domínios (LbAha1N e LbAha1C) recombinantes foram obtidas puras e enoveladas. A LbAha1 é estruturada em dois domínios com diferentes estabilidades, que não interagem entre si e se enovelam independentemente, porém influenciam-se reciprocamente. Em solução, a LbAha1 se comporta como um monômero alongado e possui notável flexibilidade, com dimensão suficiente para interagir com os domínios N e M da LbHsp90. A análise da interação entre a LbAha1 e LbHsp90 revelou que a associação destas proteínas é dirigida entalpicamente, ocorrendo através de interações eletrostáticas e com estequiometria de 2 moléculas de LbAha1 por dímero de LbHsp90. O mapeamento de regiões envolvidas na interação indicou que o domínio LbAha1N e o domínio M da LbHsp90 compõem o cerne da interação e somente a LbAha1 íntegra é capaz de encaminhar a LbHsp90 para um estado fechado. Experimentos de cinética enzimática mostraram que somente a LbAha1 íntegra estimula a atividade ATPásica da LbHsp90 por meio de um mecanismo cooperativo positivo. Assim, é proposto que a conexão entre os domínios da LbAha1, via linker, é essencial para o direcionamento da LbHsp90 para um estado conformacional fechado e competente na hidrólise de ATP. / Molecular chaperones play a role in protein folding, complex assembly, prevention/recover of proteins from aggregates and targeting misfolded proteins to depuration. Hsp90 molecular chaperones work stabilizing proteins related to signaling pathways, cell growth, transcription and translation processes, genome stability, among others, and are essential to cell viability. In protozoa of the genus Leishmania, Hsp90s are indispensable for cell developing, adaptation and transformation. These factors make Hsp90s potential targets for pathologies treatment, such as leishmaniasis, a neglected tropical disease. Hsp90s are flexible homodimers and each protomer is divided into three domains named N, M and C. Hsp90s have a conformational cycle associated to its functional cycle and low ATPase activity, which is directed and regulated by auxiliary proteins, so-called cochaperones. Aha1 co-chaperone stimulates Hsp90 ATPase activity, participating on protein kinase and hormone receptors maturation. This work aimed to characterize the structure of the Aha1 from L. braziliensis (LbAha1) and its mechanism of interaction with the Hsp90 from the same organism (LbHsp90). LbAha1 is formed by two domains, LbAha1N and LbAha1C, connected to each other by a flexible linker. In vivo experiments identified LbAha1 and LbHsp90 as cognate proteins. Recombinant LbAha1 and its domains construct (LbAha1N and LbAha1C) were obtained pure and folded. LbAha1 is divided into two domains with dissimilar stabilities and they do not interact to each other. In spite of this they fold independently and influence each other reciprocally. LbAha1 behaves as an elongated monomer in solution and has a remarkable flexibility, with sufficient dimension to interact to LbHsp90 N and M domains. The analysis of the LbAha1-LbHsp90 interaction revealed that the association between these two proteins is enthalpically driven, occurring through electrostatic interactions in a stoichiometry of 2 LbAha1 molecules per LbHsp90 dimer. Domain mapping experiments indicated that LbAha1N and LbHsp90 M domains compose the core of the interaction and only full length LbAha1 is able to direct LbHsp90 toward a closed state. Enzyme kinetics experiments showed that only full length LbAha1 stimulates LbHsp90 ATPase activity through a positive cooperative mechanism. Thus, it is proposed that the connection between the LbAha1 domains, via linker, is essential to direct the LbHsp90 toward a closed and ATPase-competent conformational state.

Especies reativas de oxigenio/nitrogenio (ERO/ERN) produzidas por neutrofilos atraves do complexo NADPH oxidase (Nox2) estao diretamente associadas as acoes deleterias surgidas quando a inflamacao escapa do controle da homeostase. A ativacao da NADPH oxidase de neutrofilos requer o acoplamento das subunidades citosolicas aos componentes de granulos e translocacao do complexo a membrana do fagossoma. A PDI (Proteina Dissulfeto Isomerase, EC 5.3.4.1) e uma chaperona envolvida no trafego proteico celular, sendo encontrada na superficie de diversas celulas procarioticas e eucarioticas. Trabalhos previos sugeriram que PDI pode ser um dos componentes responsaveis pela montagem de Nox2, facilitando o enovelamento correto das subunidades do complexo e/ou auxiliando o transito das subunidades ate a membrana do fagossoma. Neste trabalho foi testada a atividade de Nox2 de neutrofilos inflamatorios correlacionada a atividade redutase de PDI de membrana e o efeito do nitroxido 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidiniloxil (Tempol) sobre esses processos. Neutrofilos dormentes apresentaram baixa atividade de PDI e nao foi detectado consumo de oxigenio associado ao sistema Nox2, conforme ensaios realizados com uso de um pseudo-substrato para PDI e monitoramento com eletrodo de Clark, respectivamente. Sob estimulo de forbol (PMA), os fagocitos consumiram quantidade significativa de oxigenio (6.5„b0.58 nmol.min-1) e apresentaram alta atividade de PDI, cerca de quatro vezes maior que as celulas dormentes. Quando os fagocitos foram previamente tratados com Tempol houve decrescimo dose-dependente da atividade de Nox2 (ED50: 45 ƒÝg/106 neutrofilos), em correlacao direta com o decrescimo da atividade de PDI. Testes com inibidores padroes de PDI (bacitracina e acido ditionitrobenzoico- DTNB) confirmaram que a inibicao de PDI determina decrescimo da atividade de Nox2, resultados obtidos atraves de ensaios espectrofotometricos (reducao de citocromo c, 550 nm) e quimioluminescentes (sistema luminol-peroxidase). Em conjunto, os resultados apontam que, simultaneamente a atividade de Nox2 em neutrofilos estimulados, ocorre atividade redutase de PDI, confirmando que essa chaperona esta diretamente associada a ativacao e/ou manutencao da atividade da oxidase fagocitaria. Adicionalmente, esse trabalho mostrou que o nitroxido Tempol e capaz de modular negativamente a atividade de Nox2, cujo efeito, ao menos em parte, e decorrente da inibicao de PDI, sugerindo um novo mecanismo anti-inflamatorio dos nitroxidos. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) is an ubiquitously expressed enzyme that catalyses the rearrangement of disulfide bonds in target proteins. Previous studies suggest that PDI, which is a chaperone involved in protein trafficking and translocates to the cell surface, may regulate the phagocytic NADPH oxidase complex (Nox2). This study examines whether the nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidinyloxy (Tempol) inhibits the regulatory activity of PDI interconnected to Nox2 in inflammatory neutrophils. Phorbol-triggered superoxide anion release was correlated with the PDI reductase activity detected in neutrophils, as determined by oxygen consumption and cleavage of a fluorescent probe, respectively. Both events were significantly inhibited in a concentration-dependent manner when neutrophils were pre-treated with Tempol, which has an ED50 of 45 M. To substantiate that Tempol’s action on PDI activity is related to Nox2 downregulation, assays with the known PDI inhibitors bacitracin and dithionitrobenzoic acid were performed to confirm their ability to decrease the neutrophil respiratory burst. This study shows that Tempol’s inhibition of Nox2 activity is correlated with decreased PDI reductase activity at the neutrophil cellular membrane, suggesting a close association between the enzymes of activated phagocytes and pointing to a novel anti-inflammatory mechanism for Tempol. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

A Proteína Dissulfeto Isomerase (PDI, E.C. 5.3.4.1), pertencente à superfamília das tiorredoxinas, é uma tiol oxidorredutase que catalisa a oxidação e redução de tióis e a isomerização de dissulfetos intramoleculares. Essa chaperona tem atividade dependente de cisteínas presentes nos sítios ativos, e está presente no retículo endoplasmático (RE) e/ou na membrana plasmática de células eucarióticas. Estudos anteriores da atividade catalítica de PDI foram realizados utilizando-se como pseudo-substratos, entre eles, a di-eosinaglutationa oxidada (Di-E-GSSG), que se mostrou ótima ferramenta para o monitoramento da atividade de dissulfeto redutase da PDI. Nesse trabalho, a síntese e purificação cromatográfica de Di-E-GSSG foram realizadas e a pureza da sonda foi verificada através de cromatografia líquida de alta performance (CLAE). A cinética enzimática da atividade redutase de PDI isolada recombinante sobre Di-E-GSSG foi estudada, caracterizando-se os principais parâmetros físico-químicos da enzima através da formação do monômero fluorescente (λexc=521nm; λemi=542 nm) eosina-glutationa reduzida (E-GSH). O valor da constante de Michaelis-Menten (Km) encontrado foi de 520,5±129,8 nM, a velocidade máxima de catálise (Vmáx) foi determinada como 1,637±0,1526 nM.min-¹ e a constante catalítica (Kcat) encontrada foi 1,364 . 10-³.s-³. São relatados na literatura poucos compostos químicos capazes de inibir a atividade catalítica da PDI. Assim, para verificar se compostos radicalares estáveis desempenham essa atividade, foram testados nitróxidos piperidínicos como possíveis inibidores de PDI. Esses compostos, que possuem propriedades antioxidantes, antiinflamatórias e radioprotetoras, apresentam efeito “scavenger” sobre diferentes espécies radicalares, dentre as quais, radicais tiila. O nitróxido 4-hidroxi-2,2,6,6- tetrametilpiperidina-1-oxil (Tempol) mostrou-se um inibidor pouco potente da atividade redutase da enzima. Entretanto, três outros nitróxidos, sintetizados especificamente para este trabalho, demonstraram maior poder de inibição, com uma correlação direta com o aumento de hidrofobicidade das estruturas químicas dos mesmos. Essa capacidade de inibição foi confirmada sobre a atividade de PDI presente em plaquetas humanas, corroborando a hipótese de que os nitróxidos são candidatos a novos fármacos moduladores de funções celulares onde esteja envolvida a atividade de PDI. / Protein disulfide isomerase (PDI, EC 5.3.4.1) belonging to the thioredoxin superfamily, is a thiol oxidoreductase that catalyzes the oxidation and reduction of thiols and intramolecular disulfide isomerization. This chaperone, such activity is dependent of cysteine located on the active sites, is present in the endoplasmic reticulum (ER) and / or plasma membrane of eukaryotic cells. Previous studies of the catalytic activity of PDI were performed using different pseudo-substrates, among them, the di-eosin-glutathione disulfide (Di-E-GSSG), described as a usefull tool for monitoring the disulfide reductase activity of PDI . In this work, the synthesis and chromatographic purification of Di-E-GSSG were performed and the purity of the probe was verified by high performance liquid chromatography (HPLC). The enzyme kinetics of the reductase activity of recombinant PDI isolated over Di-E-GSSG was studied, characterizing the main physicochemical parameters of the enzyme through the formation of the fluorescent monomer (λexc=521nm; λemi=542nm) eosin-reduced glutathione (E-GSH). The value of the Michaelis-Menten constant (Km) was found to be 520.5 ± 129.8 nM, the maximum velocity of catalysis (Vmáx) was determined as 1,637 ± 0.1526 nM.min-¹ and the catalytic constant (Kcat) found was 1.364 . 10-³.s-¹. Few chemical compounds able to inhibit catalytic activity of PDI were reported. Thus, to verify if stable free radical compounds display this activity were tested piperidine nitroxides as potential inhibitors of PDI. These compounds, which have antioxidant, anti-inflammatory and radioprotective properties are “scavengers” of different radical species, among them, thyil radicals. The nitroxide 4-hydroxy-2,2,6,6-tetrametilpiperidine-1-oxyl (Tempol) was a weak inhibitor of PDI reductase activity. However, three other nitroxides specifically synthesized for this study showed higher inhibition power, with a direct correlation between increasing the hydrophobicity of the chemical structures and inhibitory action. This ability was confirmed by assays with PDI found in human platelets, confirming the hypothesis that the nitroxides are candidates for new drugs to modulate cellular functions involving the PDI activity.