O período de puberdade, em equinos, define-se pela aparição de espermatozóides maduros no ejaculado de animais jovens, bem como a maturação das funções endócrinas. Os espermatozóides precisam passar por um processo de maturação no epidídimo. Para se obter marcadores moleculares que permitam estabelecer a fertilidade de um garanhão, é necessário um melhor conhecimento das proteínas presentes em espermatozóides imaturos e maduros, uma das quais é a PDI (proteína dissulfeto-isomerase). A PDI foi descrita também como importante marcador de fertilidade no plasma seminal e espermatozóides de diversas espécies. O objetivo deste trabalho foi identificar a presença da PDI no epidídimo equino durante a puberdade, e quantificá-la no fluido e espermatozóides epididimários. Visou verificar a presença da PDI no plasma seminal e espermatozóides ejaculados, em garanhões férteis e subférteis. Foram realizados dois experimentos: Experimento 1: utilizou-se 22 equinos Crioulos saudáveis, castrados e divididos em três grupos: G1: potros até 24 meses, G2: de 25-36 meses e G3: a partir de 36 meses. Imediatamente após a castração, foi efetuada a dissecação do epidídimo para a coleta de fluido epididimário, o qual foi separado dos espermatozoides por centrifugação a 800 g por 10minutos. O sobrenadante foi removido, e criopreservado a -196º C. Os espermatozóides foram ressuspendidos em PBS e armazenados a -196º C. Para a dosagem de proteína das amostras, utilizou-se o método de Kit BCA espectrofotômetro e a eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% SDS- Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Para a visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas quantificadas pela utilização do software livre ImageJ. A PDI foi identificada nos três grupos avaliados na análise proteômica do fluido , e espermatozoides epididimários, sendo sua quantidade inferior no G1 em relação aos grupos dois (2) e três (3). Em conclusão, a expressão da PDI nos espermatozóides e fluido epididimários de potros castrados cirurgicamente, aumenta conforme o animal atinge a maturidade sexual. Experimento 2- Utilizou-se 12 garanhões adultos que já haviam sido submetidos à pelo menos duas temporadas de monta na região da Campanha do Rio Grande do Sul, efetuando-se quatro (4) coletas de cada garanhão, fora da estação de monta, respeitando-se um intervalo de 48h entre coletas. Imediatamente após a coleta, analisou-se motilidade, vigor e concentração com auxílio de microscópio óptico e retirou-se uma alíquota de sêmen para avaliação das patologias espermáticas. A partir dos dados obtidos, os garanhões foram divididos em dois grupos: Grupo 1: motilidade não inferior a 70%, tendo-se uma média de 76,04±5,89% e histórico reprodutivo de temporadas anteriores com índice de prenhez mínimo por temporada de 80%. Grupo 2: motilidade igual ou inferior a 30%, com média de 11,83±11,21%, e histórico reprodutivo de temporadas anteriores de índices de prenhez inferiores a 35%. Efetuadas as análises, as mostras foram centrifugadas a 800 g por 10 minutos para separar o plasma seminal, de mesma forma que no Exp. 1. Os pellets passaram por ressuspensão em PBS gelado e posteriormente armazenados a -196º C. As amostras foram submetidas à dosagem das proteínas, para serem submetidas à eletroforese, utilizando-se géis de poliacrilamida a 10% SDS-Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Na visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas foram quantificadas pela utilização do software livre Image J. Ao analisar a presença da PDI no plasma seminal dos garanhões, verificou-se sua expressão em ambos os grupos; porém não houve diferença de expressão da PDI entre eles(p˂0,05). Não houve também relação da PDI com motilidade, nem com a concentração espermática. Considerando os dados obtidos no presente experimento, não foi possível relacionar a PDI com qualidade espermática e assim considerá-la como um potencial marcador de fertilidade em equinos. São necessários mais estudos que possam envolver outros fatores moleculares inclusive as demais proteínas da família das PDIs. / Puberty, in the equine species, may be defined by the appearance of mature spermatozoa in young animals´ ejaculates, as well as endocrine function maturation. One of the proteins found in immature and mature spermatozoa is PDI (protein dissulfide-isomerase). PDI was also described as an important fertility marker both in seminal plasma and sperm of many species. is responsible for rearranging dissulfide bonds, necessary for sperm adhesion proteins to link to the oocyte. The aim of this work was to identify PDI in equine epididymis during puberty, and quantify it in epididymal sperm and fluid of fertile and subfertile sperm. Two experiments were performed. Experiment 1-twenty-two healthy Crioulo colts were surgically castrated, and divided in three groups: G1: until 24 months; G2: from 25-36 months and G3: more than 36 months. Immediately after castration, testicles were measured, weighed, and the epididymis was dissecated for epididymal fluid collection, which was centrifuged at 800 g for 10minutes to separate epididymal fluid from sperm. Supernatant was removed, and cryopreserved at -196º C. Sperm were re-suspended in PBS and stored at -196º C. Protein dosing of samples was performed with BCA Kit and electrophoresis at 10% SDS-Page. To detect proteins, primary antibody was incubated for at least 6 hours at 4º C, and then incubation with secondary antibody conjugated with anti-mouse IgG or anti-rat IgG. To see bands, ECL Kit in X-ray films was used, and the bands quantified with softwareImageJ. In the three groups PDI was identified, in epididymal fluid and epididymal sperm, but in smaller amount in G1 when compared with Groups 2 and 3. In conclusion, expression of PDI in epididymal fluid and sperm of surgically castrated colts, increases as the animal attains sexual maturity. Experiment 2- The aim of this work was to verify the presence of PDI in equine seminal plasma and sperm, quantify it and to compare its expression on seminal plasma from fertile and subfertile stallions. Twelve adult stallions with at least two breeding season were used. For the study, four collections of each animal were performed. Immediately after collection, analysis of motility, velocity, concentration and sperm morphology were performed. Stallions were divided in two groups, according to the semen analysis and previous breeding history: Group 1: motility greater than 70% and previous history of pregnancy rates higher than 80%; Group 2: sperm motility less or equal than 30% and breeding history of less than 35% of pregnacy per season. After the analysis, samples were centrifuged at 800 g/10minutes to remove seminal plasma. Samples were prepared as described in Exp. 1. The expression of PDI in seminal plasma was seen in both groups, but with no statistical difference between them. There was no correlation of PDI with sperm motility or concentration. According to these findings, it is not possible to consider PDI as a fertility marker in stallions. More research is needed, involving other mollecular factors, including other PDIs family proteins.

O período de puberdade, em equinos, define-se pela aparição de espermatozóides maduros no ejaculado de animais jovens, bem como a maturação das funções endócrinas. Os espermatozóides precisam passar por um processo de maturação no epidídimo. Para se obter marcadores moleculares que permitam estabelecer a fertilidade de um garanhão, é necessário um melhor conhecimento das proteínas presentes em espermatozóides imaturos e maduros, uma das quais é a PDI (proteína dissulfeto-isomerase). A PDI foi descrita também como importante marcador de fertilidade no plasma seminal e espermatozóides de diversas espécies. O objetivo deste trabalho foi identificar a presença da PDI no epidídimo equino durante a puberdade, e quantificá-la no fluido e espermatozóides epididimários. Visou verificar a presença da PDI no plasma seminal e espermatozóides ejaculados, em garanhões férteis e subférteis. Foram realizados dois experimentos: Experimento 1: utilizou-se 22 equinos Crioulos saudáveis, castrados e divididos em três grupos: G1: potros até 24 meses, G2: de 25-36 meses e G3: a partir de 36 meses. Imediatamente após a castração, foi efetuada a dissecação do epidídimo para a coleta de fluido epididimário, o qual foi separado dos espermatozoides por centrifugação a 800 g por 10minutos. O sobrenadante foi removido, e criopreservado a -196º C. Os espermatozóides foram ressuspendidos em PBS e armazenados a -196º C. Para a dosagem de proteína das amostras, utilizou-se o método de Kit BCA espectrofotômetro e a eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% SDS- Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Para a visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas quantificadas pela utilização do software livre ImageJ. A PDI foi identificada nos três grupos avaliados na análise proteômica do fluido , e espermatozoides epididimários, sendo sua quantidade inferior no G1 em relação aos grupos dois (2) e três (3). Em conclusão, a expressão da PDI nos espermatozóides e fluido epididimários de potros castrados cirurgicamente, aumenta conforme o animal atinge a maturidade sexual. Experimento 2- Utilizou-se 12 garanhões adultos que já haviam sido submetidos à pelo menos duas temporadas de monta na região da Campanha do Rio Grande do Sul, efetuando-se quatro (4) coletas de cada garanhão, fora da estação de monta, respeitando-se um intervalo de 48h entre coletas. Imediatamente após a coleta, analisou-se motilidade, vigor e concentração com auxílio de microscópio óptico e retirou-se uma alíquota de sêmen para avaliação das patologias espermáticas. A partir dos dados obtidos, os garanhões foram divididos em dois grupos: Grupo 1: motilidade não inferior a 70%, tendo-se uma média de 76,04±5,89% e histórico reprodutivo de temporadas anteriores com índice de prenhez mínimo por temporada de 80%. Grupo 2: motilidade igual ou inferior a 30%, com média de 11,83±11,21%, e histórico reprodutivo de temporadas anteriores de índices de prenhez inferiores a 35%. Efetuadas as análises, as mostras foram centrifugadas a 800 g por 10 minutos para separar o plasma seminal, de mesma forma que no Exp. 1. Os pellets passaram por ressuspensão em PBS gelado e posteriormente armazenados a -196º C. As amostras foram submetidas à dosagem das proteínas, para serem submetidas à eletroforese, utilizando-se géis de poliacrilamida a 10% SDS-Page.Para imunodetecção das proteínas, efetuou-se a incubação do anticorpo primário específico por no mínimo, 6 horas a 4º C, e incubação com anticorpo secundário conjugado com peroxidase anti-igG de camundongo ou anti-IgG de rato. Na visualização das bandas foi utilizado o Kit de ECL em filmes de raio-X, e as bandas foram quantificadas pela utilização do software livre Image J. Ao analisar a presença da PDI no plasma seminal dos garanhões, verificou-se sua expressão em ambos os grupos; porém não houve diferença de expressão da PDI entre eles(p˂0,05). Não houve também relação da PDI com motilidade, nem com a concentração espermática. Considerando os dados obtidos no presente experimento, não foi possível relacionar a PDI com qualidade espermática e assim considerá-la como um potencial marcador de fertilidade em equinos. São necessários mais estudos que possam envolver outros fatores moleculares inclusive as demais proteínas da família das PDIs. / Puberty, in the equine species, may be defined by the appearance of mature spermatozoa in young animals´ ejaculates, as well as endocrine function maturation. One of the proteins found in immature and mature spermatozoa is PDI (protein dissulfide-isomerase). PDI was also described as an important fertility marker both in seminal plasma and sperm of many species. is responsible for rearranging dissulfide bonds, necessary for sperm adhesion proteins to link to the oocyte. The aim of this work was to identify PDI in equine epididymis during puberty, and quantify it in epididymal sperm and fluid of fertile and subfertile sperm. Two experiments were performed. Experiment 1-twenty-two healthy Crioulo colts were surgically castrated, and divided in three groups: G1: until 24 months; G2: from 25-36 months and G3: more than 36 months. Immediately after castration, testicles were measured, weighed, and the epididymis was dissecated for epididymal fluid collection, which was centrifuged at 800 g for 10minutes to separate epididymal fluid from sperm. Supernatant was removed, and cryopreserved at -196º C. Sperm were re-suspended in PBS and stored at -196º C. Protein dosing of samples was performed with BCA Kit and electrophoresis at 10% SDS-Page. To detect proteins, primary antibody was incubated for at least 6 hours at 4º C, and then incubation with secondary antibody conjugated with anti-mouse IgG or anti-rat IgG. To see bands, ECL Kit in X-ray films was used, and the bands quantified with softwareImageJ. In the three groups PDI was identified, in epididymal fluid and epididymal sperm, but in smaller amount in G1 when compared with Groups 2 and 3. In conclusion, expression of PDI in epididymal fluid and sperm of surgically castrated colts, increases as the animal attains sexual maturity. Experiment 2- The aim of this work was to verify the presence of PDI in equine seminal plasma and sperm, quantify it and to compare its expression on seminal plasma from fertile and subfertile stallions. Twelve adult stallions with at least two breeding season were used. For the study, four collections of each animal were performed. Immediately after collection, analysis of motility, velocity, concentration and sperm morphology were performed. Stallions were divided in two groups, according to the semen analysis and previous breeding history: Group 1: motility greater than 70% and previous history of pregnancy rates higher than 80%; Group 2: sperm motility less or equal than 30% and breeding history of less than 35% of pregnacy per season. After the analysis, samples were centrifuged at 800 g/10minutes to remove seminal plasma. Samples were prepared as described in Exp. 1. The expression of PDI in seminal plasma was seen in both groups, but with no statistical difference between them. There was no correlation of PDI with sperm motility or concentration. According to these findings, it is not possible to consider PDI as a fertility marker in stallions. More research is needed, involving other mollecular factors, including other PDIs family proteins.

Orientadores: Gustavo Antonio de Souza, José Vassallo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T10:53:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Baptista_MauricioZuccolotto_M.pdf: 8709827 bytes, checksum: 83a90faa4c0b3ee087444229cb9deee0 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Introdução: Evidências pré-clínicas implicam GRP78 como um possível marcador de resistência em quimioterapia baseada em antracíclicos em câncer de mama. Objetivos: O presente estudo avalia a relação entre a expressão de GRP78 no retículo endoplasmático (RE) e na membrana celular (MC) e a sobrevida global (SG) e a sobrevida livre de progressão (SLP) em pacientes tratadas com antracíclicos na adjuvância. Sujeitos e Métodos: Foram selecionadas 106 pacientes com estádios II e III de câncer de mama. Os dados clínicos foram obtidos de prontuários médicos. O microarranjo de tecidos (TMA) foi construído com blocos de parafina de tumores de mama. A expressão de GRP78 foi avaliada por imuno-histoquímica utilizando quatro cenários distintos: os cenários de alto e baixo limiar para o RE e os cenários de alto e baixo limiar para a MC. Resultados: O follow-up médio foi de 7.54 anos. Nos cenários de alto-limiar, 16% dos casos resultaram em GRP78-positiva para o RE e 40% em GRP78- positiva para a MC. Nos cenários de baixo-limiar, 74% dos casos resultaram em GRP78-positiva para o RE e 87% em GRP78-positiva para a MC. 10% dos casos mostraram nível forte (3+) de intensidade de coloração para GRP78 na MC. Ao término do seguimento não foi encontrada nenhuma relação entre a expressão de GRP78, a progressão de doença e o risco relativo de morte. O mesmo ocorreu com as probabilidades de sobrevida livre de progressão, exceto para mulheres acima de 50 anos de idade e pós-menopausadas, que tiveram um risco reduzido (RR=0.03; IC95% 0.01 a 0.40) de progressão de doença se positivas para GRP78. Não houve diferença estatisticamente significante entre as probabilidades de sobrevida em nenhum dos cenários examinados. Conclusões: Em nossa coorte, a superexpressão de GRP78 não foi significativamente associada à SG e à SLP das mulheres que receberam quimioterapia adjuvante baseada em antracíclicos. Este estudo fornece evidência que sustenta a forte atividade de GRP78 na membrana celular de células de câncer de mama. / Abstract: Introduction: Preclinical evidence implicates GRP78 as one possible marker of resistance to anthracycline-based adjuvant chemotherapy in breast cancer patients. Objectives: The present study assessed the relation between GRP78 expression in the endoplasmic reticulum (ER) and cell membrane (CM) of breast malignancies and overall (OS) and progression-free survival (PFS) of patients treated with anthracyclines in the adjuvant setting. Subjects and Methods: 106 stage II/III breast cancer patients were selected. Clinical data were retrieved from medical reports. Tissue Microarray was constructed from paraffin blocks of breast tumors. GRP78 expression was assessed by immunohistochemistry using four distinct scenarios: low and high GRP78 expression thresholds for ER and CM. Results: The median follow-up was 7.54 years. In the high-threshold scenarios, 16% of our cases were GRP78-positive for ER, and 40% were GRP78-positive for CM. In the low-threshold scenarios, 74% of our cases were GRP78-positive for ER, and 87% were GRP78-positive for CM. 10% of all cases showed strong (3+) CM staining of GRP78. By the end of the follow-up, no relation was found between GRP78 expression and disease progression and the relative risk of death. The same was true for the PFS probabilities, except for women above fifty years and postmenopausal, who had a reduced risk (RR=0.03; 95%CI 0.01 to 0.40) of disease progression if positive for GRP78. There was no statistically significant difference between the survival probabilities in any scenarios examined. Conclusions: In our cohort, GRP78 overexpression was not a predictor of OS or PFS of patients receiving anthracycline adjuvant chemotherapy. This study provides evidence supporting strong GRP78 activity in the CM of breast cancer cells. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Tocoginecologia

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T11:17:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cepeda_AnaOlivaTiroli_D.pdf: 3942958 bytes, checksum: 940e4a499333daa56fd9a4fc5899919c (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: As proteínas estão envolvidas com as mais diversas funções biológicas. No entanto, para realizar sua função adequadamente, uma proteína deve estar enovelada, ou seja, em sua conformação nativa. Para garantir isso, existe nas células, um elaborado sistema que envolve chaperones moleculares, capaz de auxiliar na prevenção do enovelamento incorreto e da agregação de proteínas Chaperones, de uma maneira geral, são proteínas que ligam e estabilizam polipeptídeos, facilitando seu enovelamento correto sem contribuir com informações conformacionais. O aumento no número de doenças provocadas pelo enovelamento incorreto de proteínas que se depositam nos tecidos na forma de amilóides (também chamadas de doenças conformacionais), tem chamado a atenção para estudos de agregados protéicos, que outrora foram considerados artefatos quando se trabalhava com esse tipo de macromolécula. Nesse sentido, o estudo de chaperones tem ganhado um interesse particular, já que são fortes candidatos ao combate de doenças amiloloidogênicas. Neste trabalho, são apresentados estudos sobre duas famílias de chaperones, a Hsp40 da subfamília A humana e duas sHsps de classe I de cana-de-açúcar, as quais estão envolvidas com o reconhecimento e a apresentação de substratos (proteínas parcialmente desenoveladas) para outras famílias de chaperones responsáveis pelo processo de reenovelamento. Essas duas famílias de chaperones em particular são também conhecidas como 'holdases¿, e são muito diversas, característica necessária para interagir com a grande diversidade de substratos em potencial que existe na célula. As duas sHsps estudadas aqui, as mais expressas em cana-de-açúcar, e a caracterização de suas estruturas e suas eficiências como chaperones, tornou possível a elaboração de uma hipótese sobre o mecanismo de ação dessas proteínas em função do aumento de temperatura. Nesse sentido, é mostrado neste trabalho que sHsps, respondem ao aumento de temperatura passando por expansão conformacional, provavelmente para aumentar a superfície hidrofóbica para a interação com os substratos. O efeito do calor sobre a Hsp40 também foi estudado e os resultados mostraram que essa proteína forma agregados com propriedades amiloidogênicas. Esta é a primeira vez que tais características são descritas para um chaperone de eucarioto. De maneira geral, as implicações dos resultados apresentados aqui podem aumentar o conhecimento geral sobre chaperones e sobre a pesquisa de tratamentos para as doenças conformacionais / Abstract: Proteins are involved with a large variety of biological functions. However, to function properly, proteins must be folded, i.e., they must reach their native conformation. According to that, an elaborated system involving molecular chaperones exists in the cell that helps to prevent the incorrect folding of proteins and also their aggregation. Chaperones, in a general way, are proteins that bind and stabilize polypeptides, facilitating its correct folding without contributing with conformational information. The increasing number of diseases caused by the incorrect folding of proteins that deposit in the form of amyloids (also called conformational diseases) has raised the interest in the study of protein aggregates, which, not long ago, where considered just purification artifacts. In this way, the study of chaperones has gained particular interest because they are potential candidates against amyloidogenic diseases. In this work, we present studies on two families of chaperones, a human Hsp40 from subfamily A and two sugar cane sHsps from class I, which are involved in substrate (partially unfolded proteins) recognition and presentation to other chaperone families that are more active in the protein refolding process. These particular chaperones are also know as 'holdases¿ and they are usually diverse, a characteristic necessary to interact with a large variety of substrate in the cell. The two sHsps studied here are the most expressed in sugar cane and their structure and chaperone efficiency characterization made possible to elaborate a hypothesis on the mechanism of action of these proteins when temperature increases. In that matter, we were able to show that sHsps respond to an increase in temperature by undergoing conformational expansion, likely to increase the hydrophobic area for substrate interaction. The effect of heat on Hsp40 has also been studied and our results showed that this protein form aggregates with amyloidogenic properties. To our knowledge, this is the first time that such characteristics are described for an eukaryotic chaperone. To sum up, we believe that the implications of the results shown here may add to the general knowledge on chaperones and to the search of a treatment for conformational diseases / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inacio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-13T20:53:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cagliari_ThiagoCarlos_D.pdf: 4482929 bytes, checksum: a1439ac0cca9a21c77eb47d2e163c224 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: As proteinas sao macromoleculas que possuem importancia vital para o funcionamento celular, participando da maioria das reacoes biologicas e tambem como componentes estruturais. Para que uma proteina possa exercer sua funcao, precisa atingir sua estrutura nativa atraves de um processo denominado enovelamento proteico. Neste contexto, as chaperonas moleculares sao proteinas capazes de auxiliar no enovelamento de outras proteinas, atuando na prevencao de agregados, desagregacao, translocacao, ativacao, entre outros. Dentre os muitos tipos de chaperonas existentes, neste trabalho foram abordadas as chaperonas das familias Hsp100 e Hsp90, as quais estao relacionadas aos processos de desagregacao e auxilio do enovelamento de proteinas-substrato, respectivamente. O presente trabalho pretendeu produzir as proteinas recombinantes Hsp100 e Hsp82 de cana-de-acucar para a caracterizacao de suas respectivas relacoes estrutura-funcao. Para isto foram empregadas tecnicas como: dicroismo circular, fluorescencia, espalhamento dinamico de luz e ultracentrifugacao analitica. Assim, foi observado que a forca ionica do meio e capaz de influenciar a estrutura quaternaria da proteina Hsp100, a qual se apresenta hexamerica em menores concentracoes de sal. Alem disto, e capaz de reconhecer agregados proteicos formados pelas proteinas luciferase e citrato sintase em ensaios in vitro. Ja a proteina Hsp82 apresentou uma estrutura dimerica, a qual nao e influenciada pela presenca de nucleotideos e apresenta grande estabilidade termica. Finalmente, a proteina p23 humana, a qual e responsavel por auxiliar a proteina Hsp90 no enovelamento de muitas proteinas/complexos proteicos, tambem foi caracterizada. Foram observados indicios de que a regiao C-terminal, rica em residuos de aminoacidos carregados, pode possuir algum grau de estruturacao, apesar de alguns estudos na literatura indicarem o contrario. O estudo das chaperonas de cana-de-acucar foi direcionado por um trabalho previo de anotacao de sequencias relacionadas as chaperonas moleculares no banco de dados do projeto SUCEST (Sugarcane EST Genome Project), o qual foi realizado por nosso grupo de pesquisa. Alem disto, sao apresentados os resultados da anotacao das sequencias relacionadas as chaperonas de eucalipto no banco de dados FORESTs (Eucalyptus Genome Sequencing Project Consortium), possibilitando futuros estudos com estas proteinas. / Abstract: Proteins are macromolecules that are vital to the functioning cell, participating in most of the biological reactions as well as structural components. To perform its function, a protein need to achieve its native structure through a process called protein folding. In this context, the molecular chaperone proteins are able to assist in the folding of other proteins, acting in the prevention of aggregation, disaggregation, translocation, activation, among others. From all types of existing chaperones, here were highlight the Hsp100 and Hsp90 families, which are related to processes of disaggregation and assistance of substrateprotein folding, respectively. This study sought to produce the recombinant proteins Hsp100 and Hsp82 from sugar cane for the characterization of their structure-function relationships. In order to do this, some techniques were employed such as: circular dichroism, fluorescence, dynamic light scattering and analytical ultracentrifugation. As a result, it was observed that the ionic strength of the solvent is capable of influencing the quaternary structure of protein Hsp100, which presents as a hexamer in lower salt concentrations. Furthermore, it is capable of recognizing protein aggregates formed by luciferase protein and citrate synthase in in vitro essays. The Hsp82 protein showed a dimeric structure, which was not influenced by the presence of nucleotides and presented a great thermal stability. Finally, the human protein p23, which is responsible for assisting in the Hsp90 protein folding of many proteins/protein complexes, was also characterized. In spite of some studies indicating the contrary, we observed evidence that the C-terminal region, which is rich in charged amino acid residues, can possible have some structure. The sugarcane chaperones study was guided by a previous chaperone sequence annotation work in the SUCEST (Sugarcane EST Genome Project) databank performed by our research group. In addition, results regarding chaperone sequences annotation in the eucalyptus databank (FORESTs - Eucalyptus Genome Sequencing Project Consortium) were presented here as well, which can also lead to future chaperone proteins function and structure studies. / Doutorado

Orientador: Kleber Gomes Franchini / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T13:11:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Antunes_MichelleBuenodeMouraPereira_D.pdf: 4387492 bytes, checksum: bf7a9e478bc9627b01a4e45548a6f170 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Diversos tipos celulares respondem ao estresse mecânico ativando sinais que culminam com remodelamento e sobrevivência. O estresse mecânico pode atuar como agente modulador da homeostase celular e de numerosos processos patológicos. Evidências sugerem que a Quinase de Adesão Focal (FAK) medeia a resposta de miócitos cardíacos ao estresse mecânico. Contudo, os mecanismos moleculares que regulam a função da FAK ainda não são totalmente conhecidos. No presente trabalho foi demonstrado que a small heat shock protein ?B-Cristalina interage de forma direta e protege a FAK da degradação pela calpaína 2. Ensaios de pull down, cross-linking acoplado a espectrometria de massas, mutagênese sítio dirigida, docking e modelagem molecular demonstraram que as ?-hélices 1 e 4 do domínio FAT da FAK interage no sítio de ligação constituído pelas folhas ?4 e ?8 da ?B-Cristalina. Os dados funcionais e estruturais obtidos indicaram que ocorre um aumento da associação da ?B-Cristalina e o domínio FAT da FAK após mudanças conformacionais associadas com a fosforilação dependente de Src da tirosina 925. Experimentos de pull down demonstraram que a associação com a ?B-Cristalina protege a FAK da proteólise mediada pela calpaína 2. Miócitos cardíacos submetidos ao silenciamento gênico da ?B-Cristalina apresentaram uma menor quantidade de FAK detectada em 125 KDa, indicando que esta interação protege FAK da proteólise. A submissão dessas células ao estiramento cíclico revelou uma maior taxa de morte celular por apoptose, sendo que a superexpressão da FAK restaurou a viabilidade celular. Os achados deste trabalho indicam que o complexo formado entre FAK e ?B-Cristalina apresenta papel fundamental na proteção da FAK da proteólise durante o estresse mecânico, sendo importante na manutenção da sobrevivência celular / Abstract: Cell types of diverse function respond to mechanical stress by triggering downstream signals for remodelling and survival. As such, mechanical stress impacts organismal homeostasis and numerous pathologic processes. Evidence suggests that focal adhesion kinase (FAK) mediates the responses of myocytes to mechanical stress, yet the molecular mechanisms to regulate FAK function are unclear. We find that FAK is recognized and protected from calpain-induced degradation by the small heat shock protein alpha-B crystalline (CryAB). A model based in the pull down, crosslinking technology coupled with mass spectrometry, site-directed mutagenesis, molecular docking and molecular modeling indicated that a cleft formed by ?4 and ?8 sheets of ?B-Crystalline is critical to the interaction with ?-helix 1 and ?-helix 4 of FAK. Functional and structural data indicated that CryAB binds directly the FAT domain of FAK upon changes in conformation associated with Src-dependent phosphorylation of tyrosine 925 induced by cell stretch. Pulldown assay indicated that ?B-Crystalline interacts and protects from calpain-induced degradation FAK. Cardiomyocytes depleted of CryAB show reduced FAK quantity detected in 125KDa, indicating that this interaction protects degradation of FAK. The submission of such cells to stretch cyclic revealed a higher rate of cell death via apoptosis, whereas restoration of FAK expression restored cell viability. Our findings highlight a new role for CryAB in forming a complex with FAK that is essential for regulating cardiomyocyte survival in response to mechanical stress / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Ciências

Orientadores: Carlos Henrique Inácio Ramos, Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T16:30:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_YurideAbreu_D.pdf: 5998927 bytes, checksum: dad9a44995521aa0e68ad9507bd61765 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As bactérias patogênicas gram-negativas desenvolveram estratégias sofisticadas para infectar seus hospedeiros, utilizando sistemas de secreção especializados para translocar proteínas de virulência através da membrana das células eucarióticas para o citoplasma. Para que este processo seja eficiente, estas proteínas de virulência devem estar parcialmente enoveladas ou mesmo desenoveladas para que possam ser transportadas para o interior das células hospedeiras através desses sistemas de secreção. Uma vez dentro das células alvo, as proteínas de virulência são encaminhadas ao seu estado nativo e ativadas pela própria maquinaria de enovelamento da célula hospedeira. As proteínas responsáveis em auxiliar o enovelamento protéico nas células são as chaperonas, denominadas classicamente de proteínas de choque térmico (Hsps). Plantas, por serem organismos sésseis, são muito mais vulneráveis a fatores de estresse biótico e abiótico, tornando o papel das Hsps ainda mais relevante para a homeostase protéica e viabilidade celular. O estudo das proteínas da família Hsp90 é muito difundido devido ao seu papel fundamental desempenhado nas situações de infecção e em diferentes tipos de estresse. Neste trabalho, a proteína recombinante Hsp90 de laranja doce (Citrus sinesis) foi clonada e purificada com o objetivo de estudar o mecanismo geral de infecção do fitopatógeno bacteriano de espécies de citros Xanthomonas citri (Xac). Investigou-se a interação, combinando técnicas de western blot e ensaios de pull-down, entre a Hsp90 e todas as quatro variantes da PthA, principal fator de virulência de Xac, e as co-chaperonas da Hsp90 de laranja ciclofilina (Cyp) e uma proteína tiorredoxina-"like? (TDX). Estas proteínas já foram descritas por se apresentarem reguladas positivamente na laranja doce durante a infecção com Xac, apontando para um possível papel da Hsp90 na formação de um complexo de enovelamento capaz de ativar as proteínas de virulência de Xac no interior das células infectadas. Além disso, investigamos a estrutura e função da Hsp90 de laranja doce que apresentou-se enovelada e solúvel, como medido por dicroísmo circular (CD), espectroscopia de fluorescência intrínseca e espalhamento de luz dinâmico (DLS). A Hsp90 se apresentou como um dímero em solução com um raio de Stokes de 62 Å, e altamente resistente á desnaturação por temperatura, como medido por CD. A proteína mostrou-se funcional, como medido pela sua capacidade de proteger a agregação da citrato sintase in vitro em um ensaio de espalhamento de luz. O estudo do efeito de nucleotídeos na conformação e função da Hsp90 através de CD, fluorescência intrínseca e de espalhamento de raios-X a baixos ângulos (SAXS) mostram alterações na conformação da proteína na presença destes ligantes / Abstract: Gram-negative bacterial pathogens, which have developed sophisticated strategies to infect hosts, use specialized secretion systems to secrete and translocate virulence proteins across the eukaryotic cell membrane into the cytoplasm. The translocation process depends on unfolded or partially folded virulence proteins to be transportated through the secretion system into the target inner cell where they are folded by the host chaperone machinery. Auxiliary proteins are responsible to help folding in cells and are known as molecular chaperones, or heat shock proteins (HSPs). Plants, being sessile organisms, are much more vulnerable to biotic and abiotic stress factors, making the role of HSPs even more important for protein homeostasis and cell viability. The study of the Hsp90 family is widespread due to the key role played in situations of infection and under various types of stress. In this work, an Hsp90 sweet orange (Citrus sinesis) was cloned and purified in order to study the general mechanism of infection of the bacterial pathogen of citrus species, Xanthomonas citri (Xac). First, we investigated the interaction, by combining immunostaining and pull-down assays, between Hsp90 and all four variants of PthA, the major virulence factor of Xac, and the orange Hsp90 cochaperonas cyclophilin (Cyp) and a thioredoxin-like protein (TDX). These proteins have been described to be upregulated in sweet orange during infection with Xac, pointing to a possible role of Hsp90 in the formation of a folding complex able to activate the virulence proteins of Xac inside the infected cells. Furthermore, we took to investigate the structure and function of the Hsp90 from sweet orange, which was folded and soluble as measured by circular dichroism (CD), intrinsic fluorescence spectroscopy and dynamic light scattering (DLS). Hsp90 was a dimer in solution with a Stokes radius of about 62 Å, tolerating up to 90 °C without denaturation, as measured by CD. The protein was functional, as measured by its ability to protect the aggregation of citrate synthase in an light scattering assay. The study of the effect of nucleotides on the conformation and function of Hsp90 by CD, intrinsic fluorescence and small-angle X-ray scattering (SAXS) show evidence of conformation modulation by ATP and ADP / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:37:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gava_LisandraMarques_D.pdf: 9573403 bytes, checksum: 4d69a29d08ffc20e4544b876f131fb0d (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A função biológica das proteínas está relacionada à sua estrutura tridimensional adquirida pelo processo de enovelamento protéico. Neste contexto, proteínas denominadas, genericamente, de chaperonas moleculares exercem papel fundamental atuando no auxílio do enovelamento correto, no reenovelamento e na dissociação de agregados protéicos. A Hsp90 é uma das chaperonas moleculares mais importantes, é essencial para a viabilidade celular em eucariotos e está normalmente associada a proteínas atuantes no ciclo e sinalização celular, o que torna essa chaperona um alvo bastante interessante para abordagens terapêuticas de diversas doenças. A Hsp90 pode ser modulada por co-chaperonas diversas. Nesse trabalho foram caracterizadas as proteínas CHsp90 (domínio C-terminal da Hsp90 humana), e as co-chaperonas Hop e Tom70, além da interação entre C-Hsp90 e Tom70. Foram aplicadas técnicas de dicroísmo circular e emissão de fluorescência do triptofano; seguidas pela caracterização por ultracentrifugação analítica, gel filtração analítica, espalhamento dinâmico de luz, cromatografia de gel filtração acoplada a espalhamento de luz em multi-ângulos (SEC-MALS) e gel nativo. Para os ensaios de interação foram aplicadas técnicas de pull-down, SEC-MALS e calorimetria de titulação isotérmica. As proteínas foram produzidas puras e enoveladas, com estado oligomérico determinado como dímero para C-Hsp90 e monômero para Hop e Tom70, sendo que essas também foram encontradas como espécies diméricas. A estequiometria de interação entre a C-Hsp90 e Tom70 foi determinada em 1 monômero da Tom70 para 1 dímero da C-Hsp90, com KD de 360 ± 30 nM, ?Happ = -2,6 ± 0,1 kcal/mol e ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, sugerindo que a interação é dirigida por entalpia e entropia. Os resultados obtidos nesse trabalho contribuem para uma melhor compreensão do sistema Hsp90, que está envolvido em diversos processos celulares essenciais e patológicos, como doenças neurodegenerativas, processos inflamatórios, infecções e câncer / Abstract: The biological function of proteins is related to its three dimensional structure acquired via protein folding process. In this context, the molecular chaperones play a key role acting as auxiliary protein on protein folding, refolding and dissociation of protein aggregates. Hsp90 is one of the most important molecular chaperones, is essential for cell viability in eukaryotes and is usually associated with proteins involved in cell cycling and cell signaling, which makes these chaperone a very interesting targeting for therapeutic approaches for several diseases. The chaperone activity of Hsp90 can be modulated by other proteins, called co-chaperones. In this work, we characterized the protein C-Hsp90 (Cterminal domain of human Hsp90) and the co-chaperones Hop and Tom70, and also the interaction between C-Hsp90 and Tom70. Circular dichroism and fluorescence emission of tryptophan was first applied for initial characterization of the proteins, followed by analytical ultracentrifugation, analytical gel filtration, dynamic light scattering, size exclusion chromatography - multi angle light scattering (SEC-MALS) and native gel. The interaction between C-Hsp90 and Tom70 were measured by techniques like pull-down, SEC-MALS and isothermal titration calorimetry. The proteins were produced pure and soluble and their oligomeric state were determined as dimer for C-Hsp90, and monomer for Hop and Tom70, these two co-chaperones were also found as dimeric species. The stoichiometry of interaction between C-Hsp90 and Tom70 was determined by SEC-MALS and ITC as been 1 dimer of C-Hsp90 to 1 monomer of Tom70, with a KD of 360 ± 30 nM, ?Happ = -2.6 ± 0.1 kcal/mol and ?S = 21 ± 1 cal/mol.K, suggesting that these interaction is driven by both, enthalpy and entropy. The results contribute to a better understanding of the important Hsp90 machinery, which is involved in many essential cellular and pathological processes, such as neurodegenerative diseases, inflammation, infection and cancer / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientadoesr: Carlos Henrique Inácio Ramos, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T06:21:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Goncalves_DanieliCristina_M.pdf: 10469841 bytes, checksum: df29d5b11d3cdd27679b971b2bbcb032 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Chaperonas moleculares (Heat Shock proteins - HSPs) são componentes chave do sistema de controle de qualidade de proteínas (PQC - Protein Quality Control), que é essencial para a vida, sendo responsável por manter a homeostase proteica e a adequada função de diversas vias. Problemas no processo de enovelamento estão relacionados a doenças degenerativas, amilóides e câncer. Em plantas, as chaperonas moleculares desempenham um papel crucial na proteção contra estresses bióticos e abióticos, pois como organismos sésseis, as plantas devem ser capazes de responder rapidamente a mudanças na temperatura, salinidade, déficit hídrico, entre outros. A chaperona molecular Hsp90 (Heat Shock protein 90 kDa) compreende uma família ubíqua, considerada um 'hub' por interagir com chaperonas, co-chaperonas e ter como clientes proteínas regulatórias essenciais como fatores de transcrição, quinases, receptores de hormônios, entre outros. A Hsp90 age em conjunto com co-chaperonas, as quais modulam e direcionam sua função. Uma destas co-chaperonas é a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), capaz de interagir simultaneamente com a Hsp90 e Hsp70, mediando a transferência de substratos. A Hop é composta por três domínios com repetições de tetratricopeptídeos (TPR) (TPR1, TPR2A e TPR2B), responsáveis pela interação com as chaperonas, porém a dinâmica desta interação não está bem entendida, uma vez que ainda não há estrutura da Hop inteira e o estado oligomérico desta co-chaperona ainda é controverso na literatura. Neste trabalho apresentamos a classificação de um gene de Hsp90 de cana-de-açúcar, e o início de sua caracterização funcional através de transgenia em Arabidopsis thaliana. Apresentamos também a caracterização biofísica de uma importante co-chaperona da Hsp90, a Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein) humana. Através da análise de sequências a Hsp90 de cana-de-açúcar foi classificada como Hsp90-3, uma isoforma citosólica. Plantas transgênicas de A. thaliana, produzidas a partir da inserção do gene da Hsp90-3 de cana-de-açúcar, apresentaram níveis reduzidos de Hsp90. Tal perturbação nos níveis de Hsp90 parece ter afetado a expressão de outras proteínas da rede de interações, relacionadas com processos diversos como resposta imune e fotossíntese. As plantas transgênicas também exibiram germinação mais rápida e raízes mais longas em relação ao controle. Sob estresse térmico, linhagens transgênicas apresentaram maior suscetibilidade à alta temperatura em relação ao controle. Tais resultados sugerem que a Hsp90 tem um importante papel na fisiologia celular e no desenvolvimento, e que os níveis de Hsp90 são críticos para a resposta frente a estresses. A caracterização biofísica do mutante Hop D456G, uma mutação no domínio TPR2B, mostrou que esta proteína é uma mistura de monômeros, dímeros e oligômeros maiores, porém com prevalência do estado monomérico. O resíduo D456 pode ter uma participação na dinâmica de dimerização e é possível que o estado oligomérico da Hop seja regulado entre os estados monomérico e dimérico, com a finalidade de facilitar sua atividade adaptadora / Abstract: Molecular chaperones (heat shock proteins - HSPs) are key components of protein quality-control system (PQC - Protein Quality Control), which maintains protein homeostasis and the proper function of several pathways, being essential for life. Defects in folding processes are related to degenerative diseases, amyloidosis and cancer. In plants, which as sessile organisms must be able to respond rapidly to changes in temperature, salinity, water deficit, and others, molecular chaperones play a crucial role in protecting against such biotic and abiotic stresses. Molecular chaperone Hsp90 (Heat Shock Protein 90 kDa) comprise an ubiquitous family, considered a hub as it interacts with chaperones, co-chaperones, and have as clients key regulatory proteins such as transcription factors, kinases, hormone receptors, and others. The chaperone acts together with co-chaperones, which modulate and guide Hsp90 function. The co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein), interacts simultaneously with Hsp90 and Hsp70, mediating substrate transfer. Hop has three TPR domains (TPR1, and TPR2A TPR2B) responsible for interaction with the chaperones, but this interaction dynamics remains unclear, since there is no structure of full length Hop and its oligomeric state is controversial in literature reports. This work presents the classification of an Hsp90 gene from sugarcane, and primary functional characterization studies in Arabidopsis thaliana transgenic lines. We also present the biophysical characterization of the human Hsp90 co-chaperone Hop (Hsp70-Hsp90 organizing protein). Through sequence analysis the Hsp90 from sugarcane has been classified as Hsp90-3, a cytosolic isoform. Transgenic A. thaliana, produced by Hsp90-3 insertion, exhibited reduced transcript levels of Hsp90. This disruption in Hsp90 levels seems to affect the expression of other proteins from the interaction network, which are related to various processes such as immune response and photosynthesis. Transgenics also exhibited faster germination and longer roots than the control. Under heat stress, transgenic lines showed increased susceptibility to high temperature. These results suggest that Hsp90 has an important role in cellular physiology and development; in addition the levels of Hsp90 are critical for responses to stresses. The biophysical characterization of the mutant D456G Hop, a mutation in domain TPR2B showed that this protein is a mixture of monomers, dimers and higher oligomers, but the monomeric state is majoritary. The residue D456 may be involved in dimerization dynamics, and it is possible that Hop is regulated between monomeric and dimeric species, to enable its adaptor functions / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Henrique Inácio Ramos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T11:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_VivianeCristinaHeinzenda_D.pdf: 5558657 bytes, checksum: 719a2c54c3d42be8642a0beb9014221c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As chaperonas moleculares estão envolvidas na manutenção da homeostase celular, auxiliando no correto enovelamento de proteínas, e consequentemente em sua funcionalidade. Duas famílias de chaperonas moleculares participam de pontos-chave neste sistema. Uma delas é a Hsp100 que tem papel importante na desagregação de proteínas; a outra é a Hsp90 que tem o papel de auxiliar no enovelamento, ativação, e na translocação de proteínas regulatórias e sinalizadoras. Neste trabalho foram caracterizadas as chaperonas Hsp100 e Hsp90 de cana-de-açúcar, denominadas SHsp101 e SsHsp90, respectivamente, cuja expressão em níveis basais foi detectada em tecido foliar. As proteínas recombinantes foram produzidas em Escherichia coli, de maneira solúvel, e após purificação apresentaram-se enoveladas. A SHsp101 foi obtida como um hexâmero em solução, apresentando capacidade de ligar nucleotídeos ATP e ADP, e de hidrolisar o ATP de maneira alostérica com cooperatividade positiva; mas não foi capaz de hidrolisar o ADP, que por sua vez mostrou-se inibidor da atividade ATPásica. A SHsp101 exibiu atividades de proteção do substrato luciferase contra agregação induzida por alta temperatura e de desagregação e reenovelamento da proteína-modelo GFPuv, na presença de ATP e ATP?S. Análises de complementação in vivo revelaram que a superexpressão heteróloga de SHsp101 em cepas de levedura mutantes nulo de hsp104, aumentou a termotolerância a 53°C, proporcionando um aumento de 80 vezes na sobrevivência das leveduras. A SsHsp90 apresentou-se dimérica em solução, com características estruturais e conformacionais (modelo tridimensional gerado por modelagem comparativa e validado por meio de análises de ligação cruzada acoplada à espectometria de massas) semelhantes às homólogas de outros organismos. A SsHsp90 apresentou atividade chaperona de proteção contra agregação da proteína-modelo citrato sintase desnaturada por choque térmico. As informações acerca da expressão, estrutura, e função de SHsp101 e SsHsp90 obtidas neste trabalho, contribuem para um melhor entendimento destas famílias de chaperonas moleculares, particularmente em plantas, que por serem organismos sésseis, estão mais expostos às condições adversas do ambiente / Abstract: Molecular chaperones are involved in the maintenance of cellular homeostasis by promoting the correct folding of proteins, and consequently, ensuring their functionality. Two families of molecular chaperones participate at key points in this system. The first is Hsp90, which assists in protein refolding, activation, and the trafficking of regulatory and signaling proteins, while the second is Hsp100, which has an important role in protein disaggregation. In this study, the Hsp90 and Hsp100 proteins from sugarcane were characterized, denoted as SsHsp90 and SHsp101, respectively, and their basal level of expression was detected in leaf tissue. In addition, both were produced by Escherichia coli as soluble form and then they were purified in a folded state. The SHsp101 was obtained folded as hexamer in solution and showed capacity of bind both ATP and ADP, but could only hydrolyze ATP in an allosteric manner with positive cooperativity. In fact, the presence of ADP had an inhibitory effect on the ATPase activity. SHsp101 exhibited protection against aggregation of luciferase, and showed a disaggregation and refolding activity of GFPuv in the presence ATP and ATP?S. In vivo complementation analysis revealed that heterologous overexpression of SHsp101 in a null hsp104 yeast strain correlated with an 80 fold increase in yeast survival at 53°C. The dimer obtained for SsHsp90 had similar structural and conformational characteristics compared to other Hsp90 homologues, and was compatible with a three-dimensional model generated by comparative modeling, which was validated by cross-linking coupled to mass spectrometry. The SsHsp90 protected against thermal aggregation of citrate synthase. Taken together, the information about the expression, structure, and function of SHsp101 and SsHsp90 obtained in this study contribute to a better understanding of these molecular chaperone protein families, particularly in plants, which are sessile organisms and more exposed to adverse environmental conditions / Doutorado / Bioquimica / Doutora em Biologia Funcional e Molecular