A inseminação artificial utlizando sêmen criopreservado de garanhões apresenta uma baixa utilização, principalmente pela variabilidade dos resultados e aumento dos custos relacionados à inseminação. Os lipídeos presentes nas membranas plasmáticas dos espermatozóides participam de diversos eventos associados à fertilização e por sofrerem alterações químicas e estruturais durantes os processos necessários à congelação podem estar relacionados a congelabilidade dos ejaculados. Este trabalho foi composto por dois experimentos. O experimento I utilizou amostras de espermatozóides de seis garanhões e seis touros e objetivou avaliar a possibilidade de análise direta das amostras de espermatozóides e o efeito do armazenamento em metanol por um período de 45 dias a -80°C. As amostras foram coletadas, \"lavadas\" por centrifugações sucessivas e armazenadas nos seguintes meios: PBS Ca++ Mg++ Free, Metanol padrão-HPLC e solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. As amostras em PBS foram analisadas após extração lipídica ou adição de metanol padrão-HPLC previamente à análise. Foi confirmada a possibilidade de análise direta da composição lipídica em MALDITOF, sem necessidade de extração. O armazenamento em metanol ou solução contendo o mesmo não resultou em degradação no período observado, no entanto o armazenamento de amostras previamente extraídas por longos períodos resultaram em resultados alterados. O experimento II utilizou amostras de 16 garanhões, armazenadas em solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. Os ejaculados de origem destas amostras foram submetidos à congelação e os resultados de análise in vitro de motilidade e morfologia espermática foram relacionados com os dados de composição lipídica através da análise dos componentes principais (PCA). Não foi observada nenhuma relação entre os resultados de análise seminal in vitro e a composição lipídica, apesar de alguns autores encontrarem tal relação, principalmente quanto à relação de determinados ácidos graxos e conteúdo total de fosfolipídeos. Estes autores utilizaram técnicas complexas, impossibilitando a aplicação na rotina veterinária a campo. A facilidade de preparo das amostras para MALDI-TOF torna esta técnica viável para análise de composição lipídica, no entanto novos testes devem ser realizados incluindo um maior número de amostas e dados de fertilidade a campo. / Artificial insemination with stallions\' frozen semen have not been widely used, mainly due to the high variability of field results and the increased cost associated with it. Sperm cell membrane lipids play an important role on several events associated with fertilization. These cells go through structural and chemicals changes during freezing and might participate in the freezeability of ejaculates. This work was composed by two experiments. In Experiment I sperm samples from six bulls and six stallions were collected, \"washed\" through centrifugation and stored at -80° in the following mediums: PBS Ca++ Mg++ Free, Methanol HPLC-standard and a solution 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard. The samples on PBS were analyzed immediately after lipid extraction or after the addition of methanol. These samples were evaluated onthe day after collection and 45 days later for evaluation of the possibility of a direct analyses with methanol and the effect of long periods of storage with methanol on lipid degradation. The possibility of an extraction-free direct MALDI-TOF analysis was confirmed. The storage with methanol did not resulted in lipid degradation for the period studied, however the storage of previously extract samples resulted on irregular spectrums. In Experiment II 16 sperm samples from stallions were collected and frozen. An aliquot of 500µl from each sample was washed through centrifugation and stored with a 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard solution. In vitro sperm analysis of motility and morphology were studied for relations with the lipid profile through a principal components analysis (PCA). It was not observed relation between lipid profile and sperm motility and morphology, as previously reported by others authors. However, these authors methodology were highly complex , making it difficult for field application. MALDI-TOF sample preparation its easy and fast and new test with a larger number of samples and field fertility results may prove this is a viable tool for improving field results with frozen semen artificial insemination.

A inseminação artificial utlizando sêmen criopreservado de garanhões apresenta uma baixa utilização, principalmente pela variabilidade dos resultados e aumento dos custos relacionados à inseminação. Os lipídeos presentes nas membranas plasmáticas dos espermatozóides participam de diversos eventos associados à fertilização e por sofrerem alterações químicas e estruturais durantes os processos necessários à congelação podem estar relacionados a congelabilidade dos ejaculados. Este trabalho foi composto por dois experimentos. O experimento I utilizou amostras de espermatozóides de seis garanhões e seis touros e objetivou avaliar a possibilidade de análise direta das amostras de espermatozóides e o efeito do armazenamento em metanol por um período de 45 dias a -80°C. As amostras foram coletadas, \"lavadas\" por centrifugações sucessivas e armazenadas nos seguintes meios: PBS Ca++ Mg++ Free, Metanol padrão-HPLC e solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. As amostras em PBS foram analisadas após extração lipídica ou adição de metanol padrão-HPLC previamente à análise. Foi confirmada a possibilidade de análise direta da composição lipídica em MALDITOF, sem necessidade de extração. O armazenamento em metanol ou solução contendo o mesmo não resultou em degradação no período observado, no entanto o armazenamento de amostras previamente extraídas por longos períodos resultaram em resultados alterados. O experimento II utilizou amostras de 16 garanhões, armazenadas em solução 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free e Metanol padrão-HPLC. Os ejaculados de origem destas amostras foram submetidos à congelação e os resultados de análise in vitro de motilidade e morfologia espermática foram relacionados com os dados de composição lipídica através da análise dos componentes principais (PCA). Não foi observada nenhuma relação entre os resultados de análise seminal in vitro e a composição lipídica, apesar de alguns autores encontrarem tal relação, principalmente quanto à relação de determinados ácidos graxos e conteúdo total de fosfolipídeos. Estes autores utilizaram técnicas complexas, impossibilitando a aplicação na rotina veterinária a campo. A facilidade de preparo das amostras para MALDI-TOF torna esta técnica viável para análise de composição lipídica, no entanto novos testes devem ser realizados incluindo um maior número de amostas e dados de fertilidade a campo. / Artificial insemination with stallions\' frozen semen have not been widely used, mainly due to the high variability of field results and the increased cost associated with it. Sperm cell membrane lipids play an important role on several events associated with fertilization. These cells go through structural and chemicals changes during freezing and might participate in the freezeability of ejaculates. This work was composed by two experiments. In Experiment I sperm samples from six bulls and six stallions were collected, \"washed\" through centrifugation and stored at -80° in the following mediums: PBS Ca++ Mg++ Free, Methanol HPLC-standard and a solution 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard. The samples on PBS were analyzed immediately after lipid extraction or after the addition of methanol. These samples were evaluated onthe day after collection and 45 days later for evaluation of the possibility of a direct analyses with methanol and the effect of long periods of storage with methanol on lipid degradation. The possibility of an extraction-free direct MALDI-TOF analysis was confirmed. The storage with methanol did not resulted in lipid degradation for the period studied, however the storage of previously extract samples resulted on irregular spectrums. In Experiment II 16 sperm samples from stallions were collected and frozen. An aliquot of 500µl from each sample was washed through centrifugation and stored with a 1:1 PBS Ca++ Mg++ Free and Methanol HPLC-standard solution. In vitro sperm analysis of motility and morphology were studied for relations with the lipid profile through a principal components analysis (PCA). It was not observed relation between lipid profile and sperm motility and morphology, as previously reported by others authors. However, these authors methodology were highly complex , making it difficult for field application. MALDI-TOF sample preparation its easy and fast and new test with a larger number of samples and field fertility results may prove this is a viable tool for improving field results with frozen semen artificial insemination.

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: A recuperação de espermatozoides da cauda do epidídimo é uma das principais alternativas nos casos de óbito inesperado, eutanásia, processos obstrutivos ou castração terapêutica. Nessa técnica os espermatozoides não entram em contato com o plasma seminal, não incorporando seus constituintes, que interferem nos processos fisiológicos importantes para fertilização, como a ligação dos espermatozoides ao reservatório da tuba uterina, que aumenta a vida útil do espermatozoide e diminui as chances de poliespermia. Nesse sentido o objetivo do presente trabalho foi comparar a cinética e ligação da tuba uterina aos espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo com e sem adição de plasma seminal. Utilizou-se 8 garanhões da raça Minihorse para o resgate de espermatozoides da cauda do epidídimo pela técnica de fluxo retrógrado. Após a colheita foi dividido em 4 grupos, LD apenas com diluente a base de leite desnatado, GO recebeu adição de diluente para congelação a base de gema de ovo, PSB plasma seminal de garanhão com alta fertilidade e capacidade de refrigeração, e PSR plasma seminal de garanhão com fertilidade e capacidade de refrigeração inferiores. Foi avaliado cinética, integridade de membrana espermática e a taxa de ligação à explantes da tuba uterina. Não apresentaram diferença na integridade da membrana nem na taxa de ligação, no entanto, observou-se diferença quanto a cinética espermática. Conclui-se que a adição de plasma seminal de diferentes garanhões interferiu, de for... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sperm retrieval from the tail of the epididymis is one of the main alternatives in cases of unexpected death, euthanasia, obstructive processes, therapeutic castration. In this technique spermatozoa do not come into contact with the seminal plasma, not incorporating their constituents, which interfere in the physiological processes important for fertilization, such as sperm binding to the uterine tube reservoir, which increases sperm life and decreases the chances of polyspermia. In this sense, the objective of the present study was to compare the kinetics and uterine tubal attachment to the spermatozoa recovered from the tail of the epididymis with and without addition of seminal plasma. Eight minihorse stallions were used to retrieve spermatozoa from the tail of the epididymis by the retrograde flow technique. After harvesting was divided into 4 groups, LD only with diluent the skim milk base, GO received addition of diluent for freezing the egg yolk, PSB seminal stallion plasma with high fertility and cooling capacity, and PSR seminal plasma fertility and lower cooling capacity. Kinetics, spermatic membrane integrity and the rate of binding to the explants of the uterine tube were evaluated. There was no difference in membrane integrity or binding rate, however, a difference was observed in spermatic kinetics. It was concluded that the addition of seminal plasma of different stallions interfered, differently in spermatozoa kinetics of the tail of the epididymis increased t... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A criopreservação do sêmen é de muita importância para a produção de equinos pois permite o amplo comércio internacional de sêmen e a redução dos custos com transporte de animais. Entretanto, o sêmen criopreservado apresenta reduzida longevidade e integridade funcional, um obstáculo para a expansão dessa técnica. Recentes descobertas sugerem que os maiores danos durante a criopreservação de sêmen de garanhões ocorrem devido ao desequilíbrio osmótico e às espécies reativas de oxigênio. Um método para combater os efeitos deletérios da congelação é utilizar substâncias que possam amenizar os danos subletais. O objetivo desse experimento foi avaliar o efeito da adição de duas substâncias com efeito protetor celular (mio-inositol e ácido ferúlico) ao meio de congelação, na qualidade do sêmen criopreservado de garanhões. Para isso foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 5 garanhões. O sêmen foi processado para criopreservação e antes do envase foi dividido em 3 tratamentos: controle, mio-inositol (30mM) e ácido ferúlico (160 µM). As palhetas foram descongeladas e analisadas quanto a motilidade computadorizada (CASA), integridade de membrana, estado metabólico e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em microscopia de epifluorescência nos tempos 0, 2 e 4h de incubação a 37°C. Previamente foram realizadas validações da técnica de mensuração simultânea da membrana plasmática e estado metabólico (sondas PI, H33342 e resazurina) e correlação entre duas técnicas de mensuração de EROs (DCFH-DA e DCFH-DA com H33342). Os dados obtidos foram avaliados no programa SAS, versão 9,3 (SAS, 2011) utilizando ANOVA e medidas repetidas no tempo, para as validações foram realizadas regressões lineares simples. A adição de mio-inositol no diluidor de congelação resultou em maior motilidade total no tempo 2h e 4h e maior motilidade progressiva nos tempos 0 e 2h de incubação pós-descongelação em relação aos outros grupos. O tratamento com mio-inositol resultou em maior quantidade de células com membrana plasmática íntegra nos tempo 0h (53,3±1,4%); 2h (50,0±1,0%) e 4h (37,9±1,5%) de incubação que o grupo controle: 0h (48,0±1,0%); 2h (44,9±1,1%); e 4h (31,5±1,7%). O ácido ferúlico prejudicou as características de motilidade (CASA) e a integridade da membrana plasmática, entretanto melhorou o estado metabólico em todos os tempos. Conclui-se que o mio-inositol melhora as características de motilidade e a integridade de membranas espermáticas do sêmen criopreservado de equinos e que o ácido ferúlico apesar de prejudicar essas características promove melhor metabolismo espermático, mensurado pela técnica de redução da resazurina. / Sperm cryopreservation is of great importance for equine production, it assists in the international semen trade and reduce costs with animal transportation. However, frozen/thawed semen has reduced longevity and functional integrity and these is an obstacle to the expansion of this technique. The improvement in quality of cryopreserved semen is very important, especially to help become available more widely new technologies, such as sperm sexing. Recent findings suggest that the greatest damage during cryopreservation of stallion semen occur due to osmotic imbalance and the reactive oxygen species (ROS). One method to mitigate the deleterious effects of freezing is using substances that might lessen the sublethal damage. The objective of this experiment was to evaluate the quality of frozen/thawed stallion sperm after using two substances that have protective effects in the freezing medium: myo-inositol and ferulic acid. Were performed five sperm collection of 5 stallions. The semen was processed and before cryopreservation it was divided into three treatments: control, myo-inositol (30 mM) and ferulic acid (160 mM). The straws were thawed and analyzed at 0, 2 and 4 h of incubation time at 37°C. It was performed computerized motility (CASA), membrane integrity, metabolic status and ROS production using an epifluorescence microscope. Before beginning of the experiment were carried out validations of the technique of simultaneous assessment of plasma membrane and metabolic state (PI probes, H33342 and resazurin) and correlation between two measurement techniques ROS (DCFH-DA and DCFH-DA with H33342). The data were analyzed using the SAS version 9.3 (SAS, 2011) with ANOVA and repeated measures. For the probes validation were used linear regressions. The addition of myo-inositol in the freezing extender resulted in higher total motility in time 2h and 4h and increased progressive cells at 0 and 2 h of incubation post-thaw compared to the other groups. Treatment with myo-inositol resulted in a higher number of cells with intact plasma membrane in time 0h (53.3 ± 1.4%); 2h (50.0 ± 1.0%) and 4h (37.9 ± 1.5%) of incubation than the control group: 0h (48.0 ± 1.0%), 2h (44.9 ± 1.1%), and 4h (31.5 ± 1.7%). The use of ferulic acid resulted in the worst characteristics of motility (CASA) and plasma membrane integrity, however improved metabolic status at all incubation times. It is concluded that myo-inositol improves sperm motility characteristics and preserves membrane integrity of equine cryopreserved semen. Ferulic acid although impairing these characteristics, promotes better sperm metabolism, measured by resazurin test.

A criopreservação do sêmen é de muita importância para a produção de equinos pois permite o amplo comércio internacional de sêmen e a redução dos custos com transporte de animais. Entretanto, o sêmen criopreservado apresenta reduzida longevidade e integridade funcional, um obstáculo para a expansão dessa técnica. Recentes descobertas sugerem que os maiores danos durante a criopreservação de sêmen de garanhões ocorrem devido ao desequilíbrio osmótico e às espécies reativas de oxigênio. Um método para combater os efeitos deletérios da congelação é utilizar substâncias que possam amenizar os danos subletais. O objetivo desse experimento foi avaliar o efeito da adição de duas substâncias com efeito protetor celular (mio-inositol e ácido ferúlico) ao meio de congelação, na qualidade do sêmen criopreservado de garanhões. Para isso foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 5 garanhões. O sêmen foi processado para criopreservação e antes do envase foi dividido em 3 tratamentos: controle, mio-inositol (30mM) e ácido ferúlico (160 µM). As palhetas foram descongeladas e analisadas quanto a motilidade computadorizada (CASA), integridade de membrana, estado metabólico e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em microscopia de epifluorescência nos tempos 0, 2 e 4h de incubação a 37°C. Previamente foram realizadas validações da técnica de mensuração simultânea da membrana plasmática e estado metabólico (sondas PI, H33342 e resazurina) e correlação entre duas técnicas de mensuração de EROs (DCFH-DA e DCFH-DA com H33342). Os dados obtidos foram avaliados no programa SAS, versão 9,3 (SAS, 2011) utilizando ANOVA e medidas repetidas no tempo, para as validações foram realizadas regressões lineares simples. A adição de mio-inositol no diluidor de congelação resultou em maior motilidade total no tempo 2h e 4h e maior motilidade progressiva nos tempos 0 e 2h de incubação pós-descongelação em relação aos outros grupos. O tratamento com mio-inositol resultou em maior quantidade de células com membrana plasmática íntegra nos tempo 0h (53,3±1,4%); 2h (50,0±1,0%) e 4h (37,9±1,5%) de incubação que o grupo controle: 0h (48,0±1,0%); 2h (44,9±1,1%); e 4h (31,5±1,7%). O ácido ferúlico prejudicou as características de motilidade (CASA) e a integridade da membrana plasmática, entretanto melhorou o estado metabólico em todos os tempos. Conclui-se que o mio-inositol melhora as características de motilidade e a integridade de membranas espermáticas do sêmen criopreservado de equinos e que o ácido ferúlico apesar de prejudicar essas características promove melhor metabolismo espermático, mensurado pela técnica de redução da resazurina. / Sperm cryopreservation is of great importance for equine production, it assists in the international semen trade and reduce costs with animal transportation. However, frozen/thawed semen has reduced longevity and functional integrity and these is an obstacle to the expansion of this technique. The improvement in quality of cryopreserved semen is very important, especially to help become available more widely new technologies, such as sperm sexing. Recent findings suggest that the greatest damage during cryopreservation of stallion semen occur due to osmotic imbalance and the reactive oxygen species (ROS). One method to mitigate the deleterious effects of freezing is using substances that might lessen the sublethal damage. The objective of this experiment was to evaluate the quality of frozen/thawed stallion sperm after using two substances that have protective effects in the freezing medium: myo-inositol and ferulic acid. Were performed five sperm collection of 5 stallions. The semen was processed and before cryopreservation it was divided into three treatments: control, myo-inositol (30 mM) and ferulic acid (160 mM). The straws were thawed and analyzed at 0, 2 and 4 h of incubation time at 37°C. It was performed computerized motility (CASA), membrane integrity, metabolic status and ROS production using an epifluorescence microscope. Before beginning of the experiment were carried out validations of the technique of simultaneous assessment of plasma membrane and metabolic state (PI probes, H33342 and resazurin) and correlation between two measurement techniques ROS (DCFH-DA and DCFH-DA with H33342). The data were analyzed using the SAS version 9.3 (SAS, 2011) with ANOVA and repeated measures. For the probes validation were used linear regressions. The addition of myo-inositol in the freezing extender resulted in higher total motility in time 2h and 4h and increased progressive cells at 0 and 2 h of incubation post-thaw compared to the other groups. Treatment with myo-inositol resulted in a higher number of cells with intact plasma membrane in time 0h (53.3 ± 1.4%); 2h (50.0 ± 1.0%) and 4h (37.9 ± 1.5%) of incubation than the control group: 0h (48.0 ± 1.0%), 2h (44.9 ± 1.1%), and 4h (31.5 ± 1.7%). The use of ferulic acid resulted in the worst characteristics of motility (CASA) and plasma membrane integrity, however improved metabolic status at all incubation times. It is concluded that myo-inositol improves sperm motility characteristics and preserves membrane integrity of equine cryopreserved semen. Ferulic acid although impairing these characteristics, promotes better sperm metabolism, measured by resazurin test.

Orientador: Marca Antonio Alvarenga / Resumo: O presente estudo propõe avaliar a segurança da aplicação intratesticular de células tronco mesenquimais alogênicas obtidas da medula óssea e verificar o efeito DO tratamento com as células tronco mesenquimais (CTMs) em garanhões submetidos a degeneração testicular. Para o primeiro estudo, foram usados 24 garanhões sadios, nos quais os testiculos foram mensurados, termografia, ultrassonografia doppler, cinética espermática e dosagem hormonal. Os grupos foram separados aleatoriamente em grupo controle (GC) e grupo células tronco mesenquimais (CTMs). No GC foram realizadas aplicações intratesticulares com PBS (solução tampão) e no CTMs solução contendo células. Os animais foram avaliados após a aplicação e aos 15 dias foram orquiectomizados. Os fragmentos testiculares foram destinados para histologia. Os exames clínicos não mostraram declínio na condição geral dos animais após a aplicação e não houve diferença significativa nas variáveis volume, temperatura superficial e ultrassonografia testicular, cinética espermática, analise sérica hormonal e histologia em ambos os grupos. Desta forma, conclui-se que a aplicação intratesticular de CTMs alogênicas da medula óssea é um processo seguro, pois não provocou alterações locais. Para o segundo estudo, um grupo de 10 garanhões foram divididos em dois grupos: grupo controle (CT) e grupo tratado (TT). Os animais foram submetidos ao estresse térmico escrotal, acoplando uma bolsa termica nos testiculos, durante 3 horas por 3 dias consecu... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by ENDRIGO ADONIS BRAGA DE ARAUJO null (adonis.tecvet@yahoo.com.br) on 2016-04-27T02:07:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO_BHT_Araujo, EAB.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Approved for entry into archive by Felipe Augusto Arakaki (arakaki@reitoria.unesp.br) on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T16:16:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 araujo_eab_me_bot.pdf: 638286 bytes, checksum: 01feb4c9fddef023795b0f62318b20f2 (MD5) Previous issue date: 2016-02-26 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / FAPESP: 2014/00175-8

Submitted by LUIS FERNANDO MERCES CHAVES SILVA null (luisfernando.mchaves@gmail.com) on 2016-06-02T00:52:25Z No. of bitstreams: 1 TESE MESTRADO VERSÃO FINAL (LUIS FERNANDO M. C. SILVA).pdf: 2997186 bytes, checksum: 711036d97c3d4d1e8cce675ab6ad1477 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-06-06T14:47:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_lfmc_me_bot.pdf: 2997186 bytes, checksum: 711036d97c3d4d1e8cce675ab6ad1477 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-06T14:47:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_lfmc_me_bot.pdf: 2997186 bytes, checksum: 711036d97c3d4d1e8cce675ab6ad1477 (MD5) Previous issue date: 2016-04-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O surgimento das biotecnologias aplicadas ao sêmen equino, como a refrigeração e congelação, representaram um grande avanço para equinocultura, principalmente por permitir um melhor aproveitamento do ejaculado, otimizando a utilização de animais considerados geneticamente superiores. Entretanto a aplicação dessas técnicas imprime estresse térmico às células espermáticas, resultando em injúrias físicas e químicas, dentre elas uma elevação significativa na produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Quando em excesso, estes agentes instáveis são capazes de reagir e promover lesão às enzimas, lipídeos de membrana e ácidos nucleicos, reduzindo a viabilidade dos espermatozoides criopreservados. Desta maneira surge a necessidade de se introduzir elementos que desempenhem função antioxidante nos meios de refrigeração e congelação. A quercertina, um polifenol do grupo dos flavonoides, é considerada um poderoso antioxidante por reduzir o surgimento das principais EROs, quelar íons metálicos formadores de radicais livres e estabilizar a peroxidação lipídica. Apesar disto, a eficiência da aplicação deste antioxidante sobre o ejaculado equino durante o processo de criopreservação ainda é controversa e pouco referenciada, sendo necessário mais estudos para que se determine a influência de sua utilização no ejaculado de garanhões durante a refrigeração e congelação. / The emergence of biotechnologies applied to the equine semen as cooling and freezing process represented a major breakthrough for Equine, especially for allowing a better use of the ejaculate, optimizing the use of genetically superior animals. However the application of these techniques induces thermal stress on sperm cells, resulting in physical and chemical injuries, among them a significant rise in the production of reactive oxygen species (ROS). These unstable agents when in excess, are able to react and promote damage to enzymes, lipid membrane and nucleic acids, thereby reducing the viability of cryopreserved sperm. Thus is required to introduce elements that perform antioxidant function in cooling and freezing extenders. The quercertina, a polyphenol of the flavonoids group, is considered a potent antioxidant by reducing the emergence of the main ROS, chelate metal ions producers of free radicals and stabilize the lipid peroxidation. Despite this, the efficiency of application of this antioxidant on the equine ejaculate during the process of cryopreservation is still controversial and poorly referenced, requiring further studies in order to determine if there is influence of their use in the ejaculate of stallions during cooling and freezing. / FAPESP: 2014/01681-4

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O surgimento das biotecnologias aplicadas ao sêmen equino, como a refrigeração e congelação, representaram um grande avanço para equinocultura, principalmente por permitir um melhor aproveitamento do ejaculado, otimizando a utilização de animais considerados geneticamente superiores. Entretanto a aplicação dessas técnicas imprime estresse térmico às células espermáticas, resultando em injúrias físicas e químicas, dentre elas uma elevação significativa na produção de espécies reativas do oxigênio (EROs). Quando em excesso, estes agentes instáveis são capazes de reagir e promover lesão às enzimas, lipídeos de membrana e ácidos nucleicos, reduzindo a viabilidade dos espermatozoides criopreservados. Desta maneira surge a necessidade de se introduzir elementos que desempenhem função antioxidante nos meios de refrigeração e congelação. A quercertina, um polifenol do grupo dos flavonoides, é considerada um poderoso antioxidante por reduzir o surgimento das principais EROs, quelar íons metálicos formadores de radicais livres e estabilizar a peroxidação lipídica. Apesar disto, a eficiência da aplicação deste antioxidante sobre o ejaculado equino durante o processo de criopreservação ainda é controversa e pouco referenciada, sendo necessário mais estudos para que se determine a influência de sua utilização no ejaculado de garanhões durante a refrigeração e congelação. / Abstract: The emergence of biotechnologies applied to the equine semen as cooling and freezing process represented a major breakthrough for Equine, especially for allowing a better use of the ejaculate, optimizing the use of genetically superior animals. However the application of these techniques induces thermal stress on sperm cells, resulting in physical and chemical injuries, among them a significant rise in the production of reactive oxygen species (ROS). These unstable agents when in excess, are able to react and promote damage to enzymes, lipid membrane and nucleic acids, thereby reducing the viability of cryopreserved sperm. Thus is required to introduce elements that perform antioxidant function in cooling and freezing extenders. The quercertina, a polyphenol of the flavonoids group, is considered a potent antioxidant by reducing the emergence of the main ROS, chelate metal ions producers of free radicals and stabilize the lipid peroxidation. Despite this, the efficiency of application of this antioxidant on the equine ejaculate during the process of cryopreservation is still controversial and poorly referenced, requiring further studies in order to determine if there is influence of their use in the ejaculate of stallions during cooling and freezing. / Mestre

Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: O processo de criopreservação acarreta estresse oxidativo à célula espermática e a adição de antioxidantes aos meios de refrigeração e congelação de sêmen pode auxiliar na proteção dos espermatozoides contra o dano induzido pelas espécies reativas de oxigênio (ERO), incluindo perda da motilidade de forma irreversível, peroxidação lipídica e fragmentação do DNA, interferindo na capacidade de fertilização do espermatozoide. Dentre os diferentes antioxidantes, o Butil-hidroxitolueno (BHT) é um análogo sintético da vitamina E, cujo efeito protetor é atribuído a dois mecanismos: o aumento da fluidez da membrana plasmática após a incorporação do antioxidante, e o segundo por conter a cascata de peroxidação lipídica pela conversão de peroxil em hidroperóxido lipídico. O BHT foi testado em diversas espécies demonstrando melhora na motilidade, integridade de membrana plasmática e viabilidade espermática; porém, na espécie equina, a inclusão de BHT em diluentes para criopreservação de sêmen necessita ser melhor avaliada. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do BHT nas células espermáticas de equinos submetidas à criopreservação e sua capacidade de conter a peroxidação lipídica e produção de espécies reativas de oxigênio quando os espermatozoides foram submetidos a estresse. / Abstract: The process of cryopreservation brings out oxidative stress to spermatic cell and the addition antioxidant of into cooling and freezing semen extenders could assist in protection of spermatozoa against the damage induced by reactive oxygen species (ROS), including irreversible loss in motility, lipid peroxidation and DNA fragmentation, interfering with the fertilizing capacity of sperm. Among different antioxidants, the butylated hydroxytoluene (BHT) is a synthetic analogue of vitamin E, whose protective effect is attributed to two mechanisms: the increase in sperm membrane fluidity after the addition of antioxidant, and the lipid peroxidation cascade for converting peroxy radicals into lipid hydroperoxides. BHT was tested in different species and the results include improvement in motility, spermatic membrane integrity and sperm viability. However, the addition of BHT in horse semen extenders for cryopreservation purposes demands further research. Thereby, the aims of this study were (1) to evaluate the influence of BHT on equine spermatic cells submitted to cryopreservation and (2) the capacity of BHT to contain the lipid peroxidation and the production of reactive species of oxygen when sperm cells were submitted to stress. / Mestre