Orientador: Frederico Ozanam Papa / Resumo: A recuperação de espermatozoides da cauda do epidídimo é uma das principais alternativas nos casos de óbito inesperado, eutanásia, processos obstrutivos ou castração terapêutica. Nessa técnica os espermatozoides não entram em contato com o plasma seminal, não incorporando seus constituintes, que interferem nos processos fisiológicos importantes para fertilização, como a ligação dos espermatozoides ao reservatório da tuba uterina, que aumenta a vida útil do espermatozoide e diminui as chances de poliespermia. Nesse sentido o objetivo do presente trabalho foi comparar a cinética e ligação da tuba uterina aos espermatozoides recuperados da cauda do epidídimo com e sem adição de plasma seminal. Utilizou-se 8 garanhões da raça Minihorse para o resgate de espermatozoides da cauda do epidídimo pela técnica de fluxo retrógrado. Após a colheita foi dividido em 4 grupos, LD apenas com diluente a base de leite desnatado, GO recebeu adição de diluente para congelação a base de gema de ovo, PSB plasma seminal de garanhão com alta fertilidade e capacidade de refrigeração, e PSR plasma seminal de garanhão com fertilidade e capacidade de refrigeração inferiores. Foi avaliado cinética, integridade de membrana espermática e a taxa de ligação à explantes da tuba uterina. Não apresentaram diferença na integridade da membrana nem na taxa de ligação, no entanto, observou-se diferença quanto a cinética espermática. Conclui-se que a adição de plasma seminal de diferentes garanhões interferiu, de for... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sperm retrieval from the tail of the epididymis is one of the main alternatives in cases of unexpected death, euthanasia, obstructive processes, therapeutic castration. In this technique spermatozoa do not come into contact with the seminal plasma, not incorporating their constituents, which interfere in the physiological processes important for fertilization, such as sperm binding to the uterine tube reservoir, which increases sperm life and decreases the chances of polyspermia. In this sense, the objective of the present study was to compare the kinetics and uterine tubal attachment to the spermatozoa recovered from the tail of the epididymis with and without addition of seminal plasma. Eight minihorse stallions were used to retrieve spermatozoa from the tail of the epididymis by the retrograde flow technique. After harvesting was divided into 4 groups, LD only with diluent the skim milk base, GO received addition of diluent for freezing the egg yolk, PSB seminal stallion plasma with high fertility and cooling capacity, and PSR seminal plasma fertility and lower cooling capacity. Kinetics, spermatic membrane integrity and the rate of binding to the explants of the uterine tube were evaluated. There was no difference in membrane integrity or binding rate, however, a difference was observed in spermatic kinetics. It was concluded that the addition of seminal plasma of different stallions interfered, differently in spermatozoa kinetics of the tail of the epididymis increased t... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Cryopreservation of fish semen is a key to optimization of reproductive management, the formation of germplasm bank and the development of genetic improvement programs. The success of this technique depends on the management and balance of several factors such as the collection, dilution, packaging, freezing and thawing. Tambaqui semen cryopreservation protocols have been developed using 0.5 mL straws on packaging. However, the high volumes of semen produced and the elevated taxes of fecundity are presented by this specie, it is necessary to use larger volume storage containers for application to large-scale production. The objective of this study was to establish a tambaqui semen cryopreservation protocol in large straw 4,0mL, from the definition of cryosolution, equilibration time and the best ratio between temperature and time semen thawing. The semen collected was diluted, packaged in large straws, frozen in liquid nitrogen which was conditioned in dry-shipper and stored in cryogenic cylinder at -196 °C. In the first experiment, different cryosolutions (M1 - 5% 5% methylglycol; M2 - 5% 5% methylglycol+ 5% egg yolk; M3 - 10% 5% methylglycol; M4 - 10% 5% methylglycol + 5% egg yolk; M5 - 15% 5% methylglycol; M6 - 15% de 5% methylglycol + 5% egg yolk) and three equilibration times (4, 20 and 40 minutes) were tested. In the second experiment, different relation between temperature and time thawing on sperm quality (30ºC for 50s - T1; 30ºC for 80s - T2; 60ºC for 25s - T3 e 60ºC for 40s - T4) were evaluated. In conclusion, this study showed that the ideal protocol for cryopreservation of tambaqui semen in large straw 4,0mL is made by diluting semen at a ratio of 1: 9 (v: v) in a medium composed of 5% methylglycol and 5% egg yolk. Both of them must have remained in contact with each other for 4 minutes until both were subjected to freezing in dry-shipper. The thawing of samples required to be performed in a water bath at 60 ° C for 25s. / A criopreservação de sêmen de peixes é uma ferramenta para a otimização do manejo reprodutivo, a formação de bancos de germoplasma e o desenvolvimento de programas de melhoramento genético. O sucesso dessa técnica depende do domínio e o equilíbrio de vários fatores que envolvem os processos de coleta, diluição, envase, congelamento e descongelamento. Protocolos de criopreservação sêmen de tambaqui já foram desenvolvidos utilizando palhetas de 0,5mL no envase, no entanto, o elevado volume de sêmen produzido e alta fecundidade da espécie sugere o armazenamento em recipientes de maior volume para a aplicação na produção em larga escala. Com isso, o objetivo do presente estudo foi estabelecer um protocolo de criopreservação seminal do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL, a partir da definição de um meio diluidor, tempo de equilíbrio e a melhor relação entre temperatura e o tempo de descongelamento do sêmen. O sêmen coletado foi diluído, envasado em macropalhetas, congelado em vapor de nitrogênio líquido no botijão dry-shipper e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. No primeiro experimento, foram testadas diferentes composições do meio diluidor (M1 - 5% de metilglicol; M2 - 5% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M3 - 10% de metilglicol; M4 - 10% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M5 - 15% de metilglicol; M6 - 15% de metilglicol + 5% de gema de ovo) e três tempos de equilíbrio (4, 20 e 40 minutos). No segundo experimento, foram avaliadas diferentes velocidades de descongelamento do sêmen em banho-maria, sobre a qualidade espermática (30ºC por 50s - T1; 30ºC por 80s - T2; 60ºC por 25s - T3 e 60ºC por 40s - T4). Ao final do estudo concluiu-se, que o protocolo ideal para a criopreservação do sêmen do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL consiste na diluição do sêmen na proporção de 1:9 (v:v) em um meio composto por 5% de metilglicol e 5% de gema de ovo, os quais devem permanecer em contato por 4 minutos até que sejam submetidos ao processo de congelamento em botijão dry-shipper. O descongelamento das amostras deve ser realizado em banho-maria a 60°C por 25s.

The semen cryopreservation in cryotubes reduces the time needed for filling, freezing and thawing of the samples, while optimizing the procedures for artificial fertilization. However, no study has yet been performed with tambaqui semen in this container. The aim of this study was to evaluate the influence of cryotubes (1.6 and 4.5 mL) and thawing time (60ºC/70s and 60ºC/90 s) on the quality and fertility of tambaqui cryopreserved semen. For that, semen samples were diluted in freezing solution (1:9) composed with 75% glucose 290 mOsm , 10% methylglycol and 5% egg yolk, and frozen in liquid nitrogen vapor (in a dry shipper), and stored in liquid nitrogen (-196 °C). The semen samples was thawed at 60ºC in bath water during 70s or 90s and the semen quality was evaluated (Total motility - MT; Progressive motility - MP; Curvilinear velocity - VCL; Straight-line velocity - VSL and Average path velocity - VAP). In this study was also determined the time viability of spermatozoa thawed, maintained under refrigeration at 5°C, and assessed over 24 hours. Besides the kinetic parameters were evaluated sperm morphology and membrane integrity of spermatozoa. The fertilizing capacity of semen was evaluated from the samples thawed in the best time. All parameters of sperm kinetic showed higher values when the semen samples were thawed in 90 s compared to 70 s, independently of cryotube type. No significant differences were observed in sperm kinetic parameters after thawing between samples frozen in 1.6 ml and 4.5 mL cryotubes, except for total motility that was higher in 1.6 mL (47 ± 14% ) compared with 4.5 mL cryotubes (40 ± 11%), independently of thawing time. After activation, the spermatozoa significantly reduced the values of kinetic parameters within 37 seconds, except the MT which remained constant during this period. Relying on the sperm parameters evaluated (VCL, VSL, VAP and membrane integrity for both cryotubes and MT, MP and morphology only for 1.6 mL cryotube) the frozen semen maintained the quality during 3h after thawing. The fertilization rate obtained with fresh semen (74±6%) was higher than cryopreserved semen (1.6 mL - 45±9% and 4.5 mL - 41±12%). The two cryotubes did not differ in this parameter. A high correlation (p <0.05) was observed between fertility and sperm kinetics parameters (MT - 89%, MP - 86%; VCL - 79%; VSL - APV and 69% - 78%). It is concluded that 1.6 and 4.5 mL cryotubes can be used in the cryopreservation of tambaqui semen being recommended to be thawed at 60°C for 90s and their use in fertilization procedures within 3 hours after thawing since kept at 5°C. / A criopreservação de sêmen em criotubos reduz o tempo necessário para o envase, congelamento e descongelamento das amostras, além de otimizar os procedimentos de fertilização artificial. No entanto, nenhum estudo ainda foi realizado com o sêmen de tambaqui neste recipiente. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a influência do tipo de criotubo (1,6 e 4,5 mL) e do tempo de descongelamento (60ºC/70s e 60ºC/90s) sobre a qualidade e fertilidade do sêmen de tambaqui criopreservado. Para isso, amostras de sêmen foram diluídas em solução de congelamento (1:9 v/v) composta por 75% de glicose 290 mOsm, 10% de metilglicol e 5% de gema de ovo, sendo envasadas em criotubos de 1,6 e 4,5 mL, congeladas em vapor de nitrogênio líquido no botijão dry-shipper (-175ºC) e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. Para avaliação do tempo de descongelamento do sêmen, os criotubos foram imersas em água a 60°C durante 70 s ou 90 s e a qualidade espermática imediatamente avaliada (Motilidade total - MT; Motilidade progressiva - MP; Velocidade curvilinear - VCL; Velocidade em linha reta - VSL e Velocidade média da trajetória - VAP). Neste estudo foi determinado também o tempo de viabilidade dos espermatozoides descongelados, mantidos sob refrigeração a 5°C e avaliados durante 24 horas. Além dos parâmetros de cinética espermática foram avaliadas a morfologia e a integridade da membrana plasmática dos espermatozoides. A capacidade de fertilização do sêmen foi avaliada a partir das amostras descongeladas no melhor tempo. Todos os parâmetros de cinética espermática apresentaram valores superiores quando as amostras de sêmen foram descongeladas por 90s em relação ao tempo de 70s, independentemente do tipo de criotubo. Não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de cinética espermática pós-descongelamento entre as amostras congeladas nos criotubos de 1,6 e 4,5 mL, com exceção da MT que foi superior nos criotubos de 1,6 mL (47±14%) em comparação com os criotubos de 4,5 mL (40±11%), independentemente do tempo de descongelamento. Após ativação, os espermatozoides reduziram significativamente os valores dos parâmetros de cinética dentro de 37 segundos, exceto a MT que se manteve constante neste período. Baseando-se na maior parte dos parâmetros espermáticos avaliados (VCL, VSL, VAP e Integridade da membrana plásmatica para ambos os criotubos e MT, MP e Morfologia espermática somente para o criotubo de 1,6 mL) o sêmen congelado manteve sua qualidade durante 3h após o descongelamento. A taxa de fertilização obtida com o sêmen in natura (74±6%) foi superior ao sêmen criopreservado (1,6 mL - 45±9% e 4,5 mL - 41±12%). Os dois criotubos não diferiram entre si neste parâmetro. Uma alta correlação significativa (p<0,05) foi observada entre a fertilização e a cinética espermática (MT - 89%; MP - 86%; VCL - 79%; VSL - 69% e VAP - 78%). Conclui-se que os criotubos de 1,6 e 4,5 mL podem ser utilizados na criopreservação do sêmen de tambaqui, sendo recomendado seu descongelamento a 60°C por 90s e seu uso em procedimentos de fertilização dentro de 3 horas após o descongelamento desde que mantido a 5°C.