Submitted by Beatrice Ingrid Macente null (beatrice.vetuel@yahoo.com.br) on 2017-12-13T17:24:54Z No. of bitstreams: 1 Tese de doutorado - FINAL.pdf: 1497835 bytes, checksum: ec09acb806dd08292a1d4ec818d596e7 (MD5) / Approved for entry into archive by Karina Gimenes Fernandes null (karinagi@fcav.unesp.br) on 2017-12-13T18:29:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 macente_bi_dr_jabo.pdf: 1454157 bytes, checksum: 970c2725b03ed803688cfef9261d801c (MD5) / Made available in DSpace on 2017-12-13T18:29:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 macente_bi_dr_jabo.pdf: 1454157 bytes, checksum: 970c2725b03ed803688cfef9261d801c (MD5) Previous issue date: 2017-11-06 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Esta pesquisa teve por justificativa ampliar os estudos acerca da criopreservação de tecido gonadal e células espermáticas de gatos domésticos, podendo servir de modelo experimental para felinos selvagens. Objetivou-se comparar os efeitos da criopreservação sobre diferentes tamanhos de fragmentos testiculares, empregando dois crioprotetores. Utilizaram-se os testículos de 31 gatos domésticos, submetidos à orquiectomia eletiva. Os testículos foram pesados e apenas os que apresentarem pesos entre 1 e 2 g foram empregados. O tecido testicular foi dissecado e cortado em fragmentos de tamanhos pré-determinados (0,3cm3 e 0,5cm3). Uma amostra foi direcionada para as avaliações a fresco: integridade de membrana e do DNA; histopatologia; incidência de apoptoses por imuno-histoquímica; e índice de peroxidação lipídica - TBARS. A criopreservação foi feita em meio Tris-gema Equex STM suplementado com 3% de crioprotetores (glicerol e propanediol) através da técnica congelação rápida. Após a descongelação, foram realizados os mesmos testes iniciais. Os primeiros resultados obtidos com os 12 gatos iniciais apontaram na avaliação histomorfológica e pelo teste de lipoperoxidação lipídica que o glicerol foi mais eficiente que o propanediol na criopreservação de fragmentos testiculares de gatos domésticos de 0,5cm3 (Capítulo 2). No experimento seguinte, avaliaram-se os fragmentos testiculares de outros 31 gatos domésticos, seccionados nos mesmos tamanhos e criopreservados nas mesmas condições do experimento anterior, empregando-se 3% glicerol ou 3% propanediol no meio diluente Tris-gema Equex STM, utilizando a técnica de congelamento rápido, seguindo das avaliações pelos testes para dano ao DNA dos espermatozoides por meio da acridina laranja; e análise dos fragmentos teciduais semi-quantitativamente por histomorfologia e imuno-histoquímica. A avaliação imuno-histoquímica foi mais eficiente em verificar os danos às células tubulares seminíferas, sendo possível observar a marcação diferenciada da caspase presente no citoplasma e núcleo das células espermáticas, bem como na cabeça dos espermatozoides. Por meio da caspase foram verificado que os fragmentos frescos já apresentavam danos consideráveis as células teciduais e que não diferiram dos achados para os fragmentos criopreservados, demonstrando a eficiência do protocolo de congelação adotado, sem a observação de superioridade entre os dois tamanhos de fragmentos ou entre os crioprotetores. Contudo, a avaliação apenas do espermatozoides tanto pela técnica de acridina laranja, como pela imuno-histoquímica, pode-se verificar a inferioridade do propanediol em relação ao glicerol para fragmentos de 0,5 cm³ (Capítulo 3). Novas pesquisas que possam complementar os testes realizados neste estudo, como o cultivo dos fragmentos, a fertilização in vitro por meio de ICSI, ou ainda, o uso dos fragmentos para xenotrasnplantes poderiam avaliar com maior acurácia os achados das pesquisas reportadas nesta tese. / This research had the justification to broaden the studies about the cryopreservation of gonadal tissue and sperm cells of domestic cats, and could serve as an experimental model for wild cats. The objective of this study was to compare the effects of cryopreservation on different sizes of testicular fragments using two cryoprotectants. The testicles of 31 domestic cats submitted to elective orchiectomy were used. The testes were weighed and only those weighing between 1 and 2 g were used. The testicular tissue was dissected and cut into fragments of predetermined sizes (0.3cm3 and 0.5cm3). A sample was directed to fresh evaluations: membrane integrity and DNA; histopathology; incidence of apoptosis by immunohistochemistry; and lipid peroxidation index - TBARS. Cryopreservation was done on Tris-egg yolk Equex STM medium supplemented with 3% cryoprotectants (glycerol and propanediol) by the rapid freezing technique. After thawing, the same initial tests were performed. The first results obtained with the 12 initial cats showed that glycerol was more efficient than propanediol in the cryopreservation of testicular fragments of domestic cats of 0.5 cm3 (Chapter 2). In the following experiment, the testicular fragments from 31 other domestic cats, sectioned in the same sizes and cryopreserved under the same conditions as in the previous experiment, were evaluated using 3% glycerol or 3% propanediol in the Tris- egg yolk Equex STM medium, using rapid freezing technique, followed by evaluations for DNA damage of the spermatozoa by acridine orange; and analysis of the tissue fragments semi-quantitatively by histomorphology and immunohistochemistry. The immunohistochemical evaluation was more efficient in verifying the damage to the seminiferous tubular cells, being possible to observe the differentiated marking of the caspase present in the cytoplasm and nucleus of the sperm cells, as well as in the spermatozoa head. By caspase, it was verified that the fresh fragments already presented considerable damage to the tissue cells and did not differ from the findings for the cryopreserved fragments, demonstrating the efficiency of the adopted freezing protocol, without the observation of superiority between the two sizes of fragments or between the cryoprotectants. However, the evaluation of spermatozoa by both acridine orange and immunohistochemistry, the inferiority of propanediol to glycerol can be verified for fragments of 0.5 cm³ (Chapter 3). New research that could complement the tests performed in this study, such as the culture of fragments, in vitro fertilization using ICSI, or the use of fragments for xenotransplantation could more accurately assess the findings of the research reported in this thesis.

Estudos sobre a biologia reprodutiva de primatas não humanos são importantes para o desenvolvimento de biotecnologias da reprodução, visando a conservação das espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de criopreservação do sêmen de Callithrix jacchus e C. penicillata. O sêmen foi colhido pelo método da vibroestimulação peniana, de animais adultos mantidos em cativeiro. Imediatamente após a colheita, foram analisadas as variáveis volume, pH, concentração, motilidades total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossomo, atividade citoquímica mitocondrial, fragmentação de DNA e morfologia espermática. As amostras foram então refrigeradas em diluidor TEST gema de ovo sem glicerol; após este período, foi adicionado o glicerol a 4 e 6% de concentração e novas análises foram realizadas. O sêmen foi congelado em vapor de nitrogênio e finalmente em imersão em nitrogênio. As amostras foram descongeladas após um período mínimo de um mês e meio, e novas análises realizadas aos 10, 40 e 80 minutos pós-descongelação. Foi observado que o sêmen fresco de C. jacchus e C.penicillata são semelhantes em muitos aspectos. O diluidor TEST gema de ovo com o glicerol tanto a 4 como a 6% de concentração não foi eficaz para a proteção dos espermatozoides das duas espécies durante a criopreservação. São necessários outros estudos para o desenvolvimento de um protocolo de criopreservação do sêmen das duas espécies. Contudo, este trabalho contém informações que podem nortear futuros estudos sobre a criopreservação do sêmen destas e de outras espécies de primatas neotropicais. / Studies on the reproductive biology of nonhuman primates are important for the development of reproductive biotechnologies, in order to species conservation. The aim of this study was to evaluate methods for sperm cryopreservation from Callithrix jacchus and C. penicillata. Semen was collected by penile vibrostimulation from adult animals kept in captivity. Immediately after collection, the variables analyzed were volume, pH, concentration, total and progressive motility, plasma membrane integrity, acrosome integrity, cytochemical mitochondrial activity, DNA fragmentation and morphology. The samples were then chilled in TEST egg yolk extender without glycerol; after this period, the glycerol was added at concentrations of 4 and 6% and further analyzes were performed. The semen was frozen in nitrogen vapour and finally immersion in nitrogen. After a minimum of one month and a half, the samples were thawed and further analysis performed at 10, 40 and 80 minutes after thawing. Fresh semen from C. jacchus and C. penicillata were found to be similar in many aspects. The extender TEST egg yolk with glycerol as much as 4 to 6% concentration was not effective for the protection of spermatozoa from both species during cryopreservation. Further studies are needed to develop a protocol for cryopreservation of semen from both species. However, this work contains information that can guide future studies on sperm cryopreservation of these and other Neotropical primates species.

Estudos sobre a biologia reprodutiva de primatas não humanos são importantes para o desenvolvimento de biotecnologias da reprodução, visando a conservação das espécies. O objetivo deste estudo foi avaliar métodos de criopreservação do sêmen de Callithrix jacchus e C. penicillata. O sêmen foi colhido pelo método da vibroestimulação peniana, de animais adultos mantidos em cativeiro. Imediatamente após a colheita, foram analisadas as variáveis volume, pH, concentração, motilidades total e progressiva, integridade de membrana plasmática, integridade de acrossomo, atividade citoquímica mitocondrial, fragmentação de DNA e morfologia espermática. As amostras foram então refrigeradas em diluidor TEST gema de ovo sem glicerol; após este período, foi adicionado o glicerol a 4 e 6% de concentração e novas análises foram realizadas. O sêmen foi congelado em vapor de nitrogênio e finalmente em imersão em nitrogênio. As amostras foram descongeladas após um período mínimo de um mês e meio, e novas análises realizadas aos 10, 40 e 80 minutos pós-descongelação. Foi observado que o sêmen fresco de C. jacchus e C.penicillata são semelhantes em muitos aspectos. O diluidor TEST gema de ovo com o glicerol tanto a 4 como a 6% de concentração não foi eficaz para a proteção dos espermatozoides das duas espécies durante a criopreservação. São necessários outros estudos para o desenvolvimento de um protocolo de criopreservação do sêmen das duas espécies. Contudo, este trabalho contém informações que podem nortear futuros estudos sobre a criopreservação do sêmen destas e de outras espécies de primatas neotropicais. / Studies on the reproductive biology of nonhuman primates are important for the development of reproductive biotechnologies, in order to species conservation. The aim of this study was to evaluate methods for sperm cryopreservation from Callithrix jacchus and C. penicillata. Semen was collected by penile vibrostimulation from adult animals kept in captivity. Immediately after collection, the variables analyzed were volume, pH, concentration, total and progressive motility, plasma membrane integrity, acrosome integrity, cytochemical mitochondrial activity, DNA fragmentation and morphology. The samples were then chilled in TEST egg yolk extender without glycerol; after this period, the glycerol was added at concentrations of 4 and 6% and further analyzes were performed. The semen was frozen in nitrogen vapour and finally immersion in nitrogen. After a minimum of one month and a half, the samples were thawed and further analysis performed at 10, 40 and 80 minutes after thawing. Fresh semen from C. jacchus and C. penicillata were found to be similar in many aspects. The extender TEST egg yolk with glycerol as much as 4 to 6% concentration was not effective for the protection of spermatozoa from both species during cryopreservation. Further studies are needed to develop a protocol for cryopreservation of semen from both species. However, this work contains information that can guide future studies on sperm cryopreservation of these and other Neotropical primates species.

Embora o congelamento apresente vantagens em relação a outros métodos de conservação de alimentos, o mesmo causa alterações sensoriais, principalmente em produtos de origem vegetal. O morango, uma fruta muito apreciada e com formas variadas de consumo, tem comportamento sazonal e apresenta como fator limitante para o congelamento sua estrutura frágil e sensível ao processo, o que causa alterações sensoriais. Tais alterações podem ser minimizadas com a incorporação de crioprotetores, como a trealose, um dissacarídeo que vem se destacando pelo seu efeito crioprotetor em produtos congelados e desidratados. O principal objetivo deste trabalho foi verificar o efeito crioprotetor da trealose incorporada através da impregnação a vácuo em soluções de diferentes concentrações (100, 300 e 500 g/L) em morangos submetidos ao congelamento e descongelamento. As condições de impregnação foram de 5 min, aplicando pressão de -650 mmHg e 10 min de tempo de relaxamento. As alterações provocadas pelo processo de impregnação bem como a verificação do efeito crioprotetor da trealose foram identificadas através de análise de cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography- HPLC), análise colorimétrica, análise de textura, determinação do teor de sólidos solúveis, determinação do teor de umidade e perda de massa (perda por gotejamento). Os resultados mostraram que a concentração da solução de trealose exerce influência significativa no teor de umidade, teor de sólidos solúveis e teor de trealose. As amostras tratadas com soluções mais concentradas não sofreram desidratação após descongelamento. O teor de trealose, após descongelamento, permaneceu constante em todas as amostras tratadas. Todas as amostras tiveram a mesma perda de massa após descongelamento (perda por gotejamento), porém a composição da massa diferiu entre elas. Amostras tratadas com a solução mais concentrada perderam sólidos enquanto que as amostras tratadas com a menos concentrada, perderam água. Na análise de textura, a introdução da trealose não influenciou a força máxima de pico nas amostras impregnadas. Após descongelamento, todas as amostras, exceto a tradada com solução de 500 g/L, sofreram amolecimento. A parte externa dos morangos não sofreu alterações de cor devido à introdução da trealose nem devido ao congelamento e descongelamento. Na parte interna dos frutos, ocorreram variações no parâmetro L* devido à impregnação e no parâmetro b*, devido ao congelamento e descongelamento. / Although freezing offers advantages to others food conservations process, it causes sensorial changes, mostly in vegetables products. The strawberry, a quite appreciated fruit, shows different ways of use, has seasonal behavior and is limited to freezing due the sensorial changes caused by its fragile structure to freezing process. These sensorial changes can be minimized by the incorporation of cryoprotectors, as trehalose, that is known by its cryoprotector effect during freezing and dehydration. The aim of this work was to verify the trehalose cryoprotector effect in frozen and thawed strawberries introduced by vacuum impregnation with different solutions (100, 300 and 500 g/L). The impregnation conditions were 5 min of applying pressure of -650 mmHg and after atmospheric pressure was restored, the sample was maintained within the solution for 10 min (these conditions were obtained from previous experiments). The alterations caused by the vacuum impregnation and the verification of the cryoprotector effect of trehalose were identified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), color analysis, texture analysis, soluble solids content, moisture content and drip loss. The results have shown that concentration of the trehalose solution had a significant influence on the moisture content, soluble solids and trehalose content of impregnated strawberries. The samples treated with more concentration solutions did not dehydrated after thawing. The trehalose content was the same in all treated samples after thawing. All the samples showed the same drip loss due to thawing although the composition of the mass was different among the samples. Samples treated with the most concentration solution lost trehalose while the sample treated with the least concentration solutions lost water. The introduction of trehalose did not affect the maximum peak force of the impregnated samples. The freezing and the thawing process caused the softening of the samples. This effect was not observed on the sample treated with solution of 500 g/L. The introduction of trehalose did not cause significant differences in all color parameters measured on the outside of the strawberries after impregnation and thawing. In the inside of the samples, there were variation in the L* parameter caused by the vacuum impregnations and in the b* parameter caused by the freezing and thawing process.

Embora o congelamento apresente vantagens em relação a outros métodos de conservação de alimentos, o mesmo causa alterações sensoriais, principalmente em produtos de origem vegetal. O morango, uma fruta muito apreciada e com formas variadas de consumo, tem comportamento sazonal e apresenta como fator limitante para o congelamento sua estrutura frágil e sensível ao processo, o que causa alterações sensoriais. Tais alterações podem ser minimizadas com a incorporação de crioprotetores, como a trealose, um dissacarídeo que vem se destacando pelo seu efeito crioprotetor em produtos congelados e desidratados. O principal objetivo deste trabalho foi verificar o efeito crioprotetor da trealose incorporada através da impregnação a vácuo em soluções de diferentes concentrações (100, 300 e 500 g/L) em morangos submetidos ao congelamento e descongelamento. As condições de impregnação foram de 5 min, aplicando pressão de -650 mmHg e 10 min de tempo de relaxamento. As alterações provocadas pelo processo de impregnação bem como a verificação do efeito crioprotetor da trealose foram identificadas através de análise de cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography- HPLC), análise colorimétrica, análise de textura, determinação do teor de sólidos solúveis, determinação do teor de umidade e perda de massa (perda por gotejamento). Os resultados mostraram que a concentração da solução de trealose exerce influência significativa no teor de umidade, teor de sólidos solúveis e teor de trealose. As amostras tratadas com soluções mais concentradas não sofreram desidratação após descongelamento. O teor de trealose, após descongelamento, permaneceu constante em todas as amostras tratadas. Todas as amostras tiveram a mesma perda de massa após descongelamento (perda por gotejamento), porém a composição da massa diferiu entre elas. Amostras tratadas com a solução mais concentrada perderam sólidos enquanto que as amostras tratadas com a menos concentrada, perderam água. Na análise de textura, a introdução da trealose não influenciou a força máxima de pico nas amostras impregnadas. Após descongelamento, todas as amostras, exceto a tradada com solução de 500 g/L, sofreram amolecimento. A parte externa dos morangos não sofreu alterações de cor devido à introdução da trealose nem devido ao congelamento e descongelamento. Na parte interna dos frutos, ocorreram variações no parâmetro L* devido à impregnação e no parâmetro b*, devido ao congelamento e descongelamento. / Although freezing offers advantages to others food conservations process, it causes sensorial changes, mostly in vegetables products. The strawberry, a quite appreciated fruit, shows different ways of use, has seasonal behavior and is limited to freezing due the sensorial changes caused by its fragile structure to freezing process. These sensorial changes can be minimized by the incorporation of cryoprotectors, as trehalose, that is known by its cryoprotector effect during freezing and dehydration. The aim of this work was to verify the trehalose cryoprotector effect in frozen and thawed strawberries introduced by vacuum impregnation with different solutions (100, 300 and 500 g/L). The impregnation conditions were 5 min of applying pressure of -650 mmHg and after atmospheric pressure was restored, the sample was maintained within the solution for 10 min (these conditions were obtained from previous experiments). The alterations caused by the vacuum impregnation and the verification of the cryoprotector effect of trehalose were identified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), color analysis, texture analysis, soluble solids content, moisture content and drip loss. The results have shown that concentration of the trehalose solution had a significant influence on the moisture content, soluble solids and trehalose content of impregnated strawberries. The samples treated with more concentration solutions did not dehydrated after thawing. The trehalose content was the same in all treated samples after thawing. All the samples showed the same drip loss due to thawing although the composition of the mass was different among the samples. Samples treated with the most concentration solution lost trehalose while the sample treated with the least concentration solutions lost water. The introduction of trehalose did not affect the maximum peak force of the impregnated samples. The freezing and the thawing process caused the softening of the samples. This effect was not observed on the sample treated with solution of 500 g/L. The introduction of trehalose did not cause significant differences in all color parameters measured on the outside of the strawberries after impregnation and thawing. In the inside of the samples, there were variation in the L* parameter caused by the vacuum impregnations and in the b* parameter caused by the freezing and thawing process.

Embora o congelamento apresente vantagens em relação a outros métodos de conservação de alimentos, o mesmo causa alterações sensoriais, principalmente em produtos de origem vegetal. O morango, uma fruta muito apreciada e com formas variadas de consumo, tem comportamento sazonal e apresenta como fator limitante para o congelamento sua estrutura frágil e sensível ao processo, o que causa alterações sensoriais. Tais alterações podem ser minimizadas com a incorporação de crioprotetores, como a trealose, um dissacarídeo que vem se destacando pelo seu efeito crioprotetor em produtos congelados e desidratados. O principal objetivo deste trabalho foi verificar o efeito crioprotetor da trealose incorporada através da impregnação a vácuo em soluções de diferentes concentrações (100, 300 e 500 g/L) em morangos submetidos ao congelamento e descongelamento. As condições de impregnação foram de 5 min, aplicando pressão de -650 mmHg e 10 min de tempo de relaxamento. As alterações provocadas pelo processo de impregnação bem como a verificação do efeito crioprotetor da trealose foram identificadas através de análise de cromatografia líquida de alta eficiência (High Performance Liquid Chromatography- HPLC), análise colorimétrica, análise de textura, determinação do teor de sólidos solúveis, determinação do teor de umidade e perda de massa (perda por gotejamento). Os resultados mostraram que a concentração da solução de trealose exerce influência significativa no teor de umidade, teor de sólidos solúveis e teor de trealose. As amostras tratadas com soluções mais concentradas não sofreram desidratação após descongelamento. O teor de trealose, após descongelamento, permaneceu constante em todas as amostras tratadas. Todas as amostras tiveram a mesma perda de massa após descongelamento (perda por gotejamento), porém a composição da massa diferiu entre elas. Amostras tratadas com a solução mais concentrada perderam sólidos enquanto que as amostras tratadas com a menos concentrada, perderam água. Na análise de textura, a introdução da trealose não influenciou a força máxima de pico nas amostras impregnadas. Após descongelamento, todas as amostras, exceto a tradada com solução de 500 g/L, sofreram amolecimento. A parte externa dos morangos não sofreu alterações de cor devido à introdução da trealose nem devido ao congelamento e descongelamento. Na parte interna dos frutos, ocorreram variações no parâmetro L* devido à impregnação e no parâmetro b*, devido ao congelamento e descongelamento. / Although freezing offers advantages to others food conservations process, it causes sensorial changes, mostly in vegetables products. The strawberry, a quite appreciated fruit, shows different ways of use, has seasonal behavior and is limited to freezing due the sensorial changes caused by its fragile structure to freezing process. These sensorial changes can be minimized by the incorporation of cryoprotectors, as trehalose, that is known by its cryoprotector effect during freezing and dehydration. The aim of this work was to verify the trehalose cryoprotector effect in frozen and thawed strawberries introduced by vacuum impregnation with different solutions (100, 300 and 500 g/L). The impregnation conditions were 5 min of applying pressure of -650 mmHg and after atmospheric pressure was restored, the sample was maintained within the solution for 10 min (these conditions were obtained from previous experiments). The alterations caused by the vacuum impregnation and the verification of the cryoprotector effect of trehalose were identified by High Performance Liquid Chromatography (HPLC), color analysis, texture analysis, soluble solids content, moisture content and drip loss. The results have shown that concentration of the trehalose solution had a significant influence on the moisture content, soluble solids and trehalose content of impregnated strawberries. The samples treated with more concentration solutions did not dehydrated after thawing. The trehalose content was the same in all treated samples after thawing. All the samples showed the same drip loss due to thawing although the composition of the mass was different among the samples. Samples treated with the most concentration solution lost trehalose while the sample treated with the least concentration solutions lost water. The introduction of trehalose did not affect the maximum peak force of the impregnated samples. The freezing and the thawing process caused the softening of the samples. This effect was not observed on the sample treated with solution of 500 g/L. The introduction of trehalose did not cause significant differences in all color parameters measured on the outside of the strawberries after impregnation and thawing. In the inside of the samples, there were variation in the L* parameter caused by the vacuum impregnations and in the b* parameter caused by the freezing and thawing process.

Submitted by Anaclaudia Mattos Villalba (anaclaudiamattosvillalba@gmail.com) on 2016-04-09T23:49:33Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) / Approved for entry into archive by cleuza maria medina dos santos (cleuzamai@yahoo.com.br) on 2016-05-09T14:06:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-09T14:06:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao-Josie-Schwartz-Caldas.pdf: 794588 bytes, checksum: edeac2ef5d199f65023941d4036fc463 (MD5) Previous issue date: 2014 / O peixe Geophagus brasiliensis, nativo brasileiro é explorado comercialmente como peixe ornamental, podendo, no futuro, ter reduzidos os estoques naturais. Com isso, a criopreservação pode garantir a sobrevivência e diversidade genética dessa espécie nativa. O objetivo deste estudo foi testar a eficiência crioprotetora e do Dimetil sulfóxido, Etileno glicol e Glicerol em sêmen de G. brasiliensis, utilizando os parâmetros espermáticos motilidade (taxa e tempo de motilidade), integridade de membrana e DNA, funcionalidade mitocondrial e espécies reativas de oxigênio (ERO). Os machos (n=12) foram obtidos de pescadores profissionais da Laguna dos Patos, tiveram seu sêmen coletado por massagem abdominal e diluído (1:9 v/v) em Betsville Thawing Solution para avaliação dos parâmetros espermáticos. As amostras seminais foram diluídas nos difentes tratamentos com crioprotetores DMSO, EG e GLI nas concentrações (5, 10, 15 e 20%). Sendo então, congeladas em Dryshipper e posteriormente armazenadas em botijão de Nitrogênio líquido à -196ºC, por no mínimo 15 dias. Posteriormente, descongeladas em banho-maria a 37º C por 8 segundos e as análises espermáticas refeitas. Todas as análises espermáticas foram realizadas por citometria de fluxo, exceto a motilidade (taxa e tempo) analisada ao microscópio de contraste de fases. Os resultados foram avaliados estatísticamente no programa Statistix 9.0 (2008). Os tratamentos com BTS, DMSO e EG, nas concentrações de 5%, não diferiram na quantidade de ERO (P>0.05). Os tratamentos com DMSO 10, 15 e 20% obtiveram os melhores resultados de integridade de membrana (P<0.05). A Funcionalidade mitocondrial foi semelhante nos grupos com DMSO 10 e 15% e EG 5% (P>0,05). Todos os tratamentos mantiveram a integridade do DNA (P>0,05). O DMSO 10% apresentou melhores médias de motilidade (taxa e tempo), sendo essas de 24% e de 160 segundos. O DMSO 10% foi o tratamento mais eficiente na criopreservação seminal de G. brasiliensis. / The Geophagus brasiliensis fish, Brazilian native is commercially exploited as ornamental fish, and may in the future have reduced the natural stocks. Thus, cryopreservation can ensure the survival and genetic diversity of this and other native species. The aim of this study was to test the efficiency of the cryoprotectant dimethyl sulfoxide, ethylene glycol and glycerol in semen G. brasiliensis, using the sperm motility parameters (rate and time), membrane and DNA integrity, mitochondrial function and reactive oxygen species (ROS). The fishes (n = 12) were obtained from fishermen of the Patos Lagoon, The semen was collected by abdominal massage and diluted (1:9 v / v) in Betsville Thawing Solution (BTS) for evaluation of sperm parameters. The samples were diluted in cryoprotectant treatments, DMSO, EG and GLI at different concentrations (5, 10, 15 and 20%) and frozen in Dryshipper and subsequently stored in liquid nitrogen (-196 ° C) for at least 15 days. Subsequently thawed in a water bath at 37 ° C for 8 seconds and remade sperm analysis. All analyzes were performed by flow cytometry, except motility (rate and time) analyzed by phase contrast microscopy. The results were evaluated statistically in Statistix 9.0 (2008) program. Treatments with BTS, EG and DMSO, at concentrations of 5%, did not differ in the amount of ROS (p> 0.05). Treatment with DMSO 10, 15 and 20% achieved the best results of membrane integrity (P <0.05). Mitochondrial functionality was similar in the groups with 10 and 15% DMSO and 5% EG (P> 0.05). All treatments were maintained the integrity of DNA (P> 0.05). The 10% DMSO showed better average motility (rate and time) which are 24% and 160 seconds. DMSO 10% was the most effective treatment cryopreservation of semen in G. brasiliensis.

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

Durante o processo de criopreservação o espermatozóide passa por mudanças estruturais nas membranas que resulta em diminuição da fertilidade. Este estudo foi realizado para comparar os efeitos de duas técnicas de congelação (técnica convencional e técnica automatizada), curvas de congelação e o uso de três crioprotetores (glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida) sobre a motilidade, vigor e integridade das membranas espermáticas (plasmática, acrossomal e mitocondrial) do sêmen bovino. Foram utilizados cinco touros da raça Simental, coletados semanalmente por seis semanas. O semên foi avaliado e diluído em tris-gema (fração única), preparado previamente com os seguintes crioprotetores:- dimetilformamida (3%), etilenoglicol (7%) ou glicerol (7%). A metade das doses foi congelada pela técnica convencional (TC), da seguinte maneira:- seis quilogramas de gelo moído foi colocado em uma de uma caixa de isopor de 15 litros, quando então as palhetas a serem congeladas foram colocadas sobre um suporte, na posição horizontal, por 90 minutos (curva de resfriamento, -0,55°C/min). Imediatamente após, o suporte com as palhetas foi transferido para outra caixa de isopor onde as palhetas permaneceram em vapor de nitrogênio (3cm), por 15 minutos (curva de congelação, -19,1°C/min). A outra metade das palhetas foi criopreservada pela técnica automatizada (TA), utilizando-se um aparelho programável portátil de controle eletrônico (TK2000), com taxa de resfriamento de -0,23°C/minuto e taxa de congelação de -15,5°C/minuto. Após a congelação as palhetas foram mantidas em botijões criogênicos e descongeladas para avaliação da motilidade (%) e vigor (1-5) por microscopia óptica. A integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial foi avaliada utilizando-se o iodeto de propídio (PI); aglutinina de Pisum sativum conjugada a fluoresceína (FITC-PSA) e MitoTracker Green FM (MITO), respectivamente, por microscopia de epifluorescência. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do Programa StatView® (SAS Institute, Cary, NC, USA). Não houve diferenças significativas entre as técnicas e nem interação entre crioprotetor e técnica de congelação (P>0,05) para os parâmetros avaliados. Houve diferença entre os crioprotetores (P<0,05), sendo que o glicerol preservou melhor a motilidade, o vigor e a integridade das membranas plasmática, acrossomal e mitocondrial dos espermatozóides quando comparado ao etilenoglicol e a dimetilformamida. O etilenoglicol foi superior à dimetilformamida para as avaliações da motilidade e da integridade das membranas plasmática e mitocondrial (P<0,05). Uma vez que, 85% dos espermatozóides apresentaram algum grau de lesão, isto nos conduz a inferir que pesquisas são necessárias para que se obtenha melhoria nos resultados após a criopreservação do sêmen bovino / During cryopreservation, spermatozoa undergo many changes leading to membrane damage which result in decreased fertility. This study was designed to compare the effects of two freezing techniques (conventional and automated), their freezing curves and the use of three cryoprotectants (glycerol, ethylene glycol and dimethylformamide) on the motility, vigor and integrity of spermatic membranes (plasmatic, acrosomal, and mitochondrial) of bovine semen. Five Simmental bulls ranging from 24 to 36 months age were submitted one a week to semen collection for six weeks. Semen samples were evaluated and diluted in TRIS-yolk medium (one step). Each semen collection dilutors were prepared previously with each of following cryoprotectants:- glycerol (7%), ethylene glycol (7%) or dimethylformamide (3%). Half of the amount of straws (0.5 mL) was frozen by a conventional manual technique (TC), as in following protocol:- six kilograms of ground ice were placed in the bottom of a thermal box (15 L), straws were cooled on a grid placed horizontally for 90 minutes (cooling rate, -0.55°C/min), immediately transferred to another thermal box and frozen in static liquid nitrogen vapor (15 min) on the same grid placed 3 cm above the liquid nitrogen (freezing rate, -19.1°C/min). The other half of straws was frozen by automated technique (TA). TA was performed using an electronic controlled programmed machine (TK2000) which cooling rate was -0.23°C/min and freezing rate was -15.5°C/min. Straws were plunged into liquid nitrogen and stored at -196°C. The motility (%) and vigor (1-5) were assessed using optic microscopy. The integrity of plasmatic, acrosomal and mitochondrial membranes were evaluated using propidium iodide (PI), fluorescein conjugated Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and MitoTracker Green FM (MITO), respectively, by fluorescence microscopy. Effects of treatment were analyzed by StatView® Program, (SAS Institute, Cary, NC, USA). There were no significant differences (P>0.05) between the two freezing techniques and no interaction among cryoprotectant and freezing techniques for all assessed parameters. Glycerol showed better results (P<0.05) than other two cryoprotectants for motility, vigor, and integrity of plasmatic, acrosomal and mitocondrial membranes. Ethylene glycol was superior (P<0.05) than dimethylformamide in preserve motility, and integrity of plasmatic and mitochondrial membranes. Because 85% of spermatozoa showed some kind of post thawing injury, further studies are required to improve cryopreservation techniques used routinely for bovine semen

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-03-22T14:51:38Z No. of bitstreams: 1 AlanaAB_DISSERT.pdf: 4740716 bytes, checksum: e3666ea7a25906742164df387e99208b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-22T14:51:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AlanaAB_DISSERT.pdf: 4740716 bytes, checksum: e3666ea7a25906742164df387e99208b (MD5) Previous issue date: 2016-11-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The cryopreservation of somatic tissue derived from collared peccaries represents an interesting step in the obtainment and conservation of cells for nuclear transfer (cloning). In this sense, tissue vitrification protocols need to be optimized to ensure maximum preservation of viable cell characteristics. Therefore, the aims of this study were to characterize histologically the peripheral auricular integumentary system (Stage 1) and evaluate different cryoprotectants in the solid-surface vitrification of somatic tissue of collared peccaries (Stage 2). Thun, ear fragments (9.0 mm3) were collected of sixteen animals derived from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS/UFERSA). In the first stage, tissue samples were evaluated for the characterization of layers, its components and proliferative activity. For the second stage, tissue fragments were cryopreserved by solidsurface vitrification using Dulbecco modified minimum essential medium supplemented with 10% fetal bovine serum and different cryoprotectants and concentrations [dimethylsulfoxide (DMSO, 3.0 M), ethylene glycol (EG; 3.0 M) and association DMSO/EG (1.5 M; 1.5 M) in the absence and presence of sucrose (0.25M)]. After two weeks, warmed and non-vitrified (control) fragments were analyzed using histological techniques. Thus, for both steps, tissue samples were evaluated using hematoxylin-eosin and Gomori Trichrome, quantification of regions argyrophilic nucleolar organizer (AgNORs) and viability by MTT assay (3-[4,5- dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide). Also, in the first stage, fragments were analyzed by transmission electronic microscopy. Thus, in the first stage, sizes of 104.2 μm and 222.6 μm were observed in the epidermis and dermis, with a volumetric ratio of 36.6% and 58.7%, respectively. Moreover, in the epidermis were evidenced the basal layer (22.5 μm), intermediate (53.5 μm) and cornea (28.2 μm), with mean values of 65.3 epithelial cells, 43.4 melanocytes and 14.8 perinuclear halos. Already the dermis has 127 fibroblasts with 2.5 AgNORs by nucleolus. Additionally, the metabolic activity was 0.243. In the second stage, the 3.0 M EG with sucrose was able to maintain normal tissue characteristics compared with non-vitrified (control), especially for the volumetric ratio of epidermis (61.2 vs. 58.7) and dermis (34.5 vs. 36.6), number of fibroblast (90.3 vs. 127.0), and AgNOR ratio (0.09 vs. 0.17), respectively. In conclusion, the peripheral auricular integumentary system derived from collared peccaries possessed some variations compared to other mammals, as the number of layers and thickness of the epidermis, number of epithelial cells, melanocytes and proliferative parameters. Moreover, 3.0 M EG with 0.25 M sucrose resulted in a better cryoprotectant composition in the vitritification for somatic tissue of collared peccaries / A criopreservação de tecido somático de catetos representa uma etapa interessante na obtenção e conservação de células para a transferência nuclear (clonagem). Nesse sentido, protocolos de vitrificação tecidual necessitam ser otimizados para garantir a máxima conservação das características viáveis das células. Portanto, os objetivos do presente trabalho foram caracterizar histologicamente o sistema tegumentar da região auricular periférica (Etapa 1) e avaliar diferentes crioprotetores na vitrificação em superfície sólida de tecido somático de catetos (Etapa 2). Para tanto, fragmentos auriculares (9,0 mm3) foram recuperados de dezesseis animais oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA). Na primeira etapa, amostras teciduais foram avaliadas quanto à caracterização das camadas, seus componentes e atividade proliferativa. Para a segunda etapa, fragmentos teciduais foram criopreservados por vitrificação em superfície sólida em meio essencial mínimo modificado por Dulbecco suplementado com 10% de soro fetal bovino e diferentes crioprotetores e concentrações [dimetilsulfóxido (DMSO; 3,0 M), etilenoglicol (EG; 3,0 M) e associação DMSO/EG (1,5 M; 1,5 M) na ausência e presença de sacarose (0,25 M)]. Após duas semanas, fragmentos aquecidos e não criopreservados (controle) foram analisados usando técnicas histológicas. Assim, para ambas as etapas, amostras teciduais foram avaliadas usando colorações hematoxilina-eosina e tricômico de Gomori, quantificação de regiões argirofílicas organizadoras nucleolares (AgNORs) e viabilidade pelo ensaio de MTT (brometo de 3-[4,5-dimetil-tiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio). Ainda, na primeira etapa, fragmentos foram analisados por microscopia eletrônica de transmissão. Assim, na primeira etapa, tamanhos de 104,2 μm e 222,6 μm foram observados para epiderme e derme, com uma proporção volumétrica de 36,6% e 58,7%, respectivamente. Além disso, na epiderme, foram evidenciadas as camadas basal (22,5 μm), intermediárias (53,5 μm) e córnea (28,2 μm), com valores médios de 65,3 de células epidermais, 43,4 melanócitos e 14,8 de halos perinucleares. Já a derme apresentou 127 fibroblastos com 2,5 AgNORs por nucléolo. Adicionalmente, a atividade metabólica foi de 0,243. Na segunda etapa, a combinação de 3,0 M de EG com sacarose foi adequada em manter as características teciduais normais quando comparado com os fragmentos não vitrificados, especialmente para a proporção volumétrica da epiderme (61,2 vs. 58,7) e derme (34,5 vs. 36,6), número de fibroblastos (90,3 vs. 127,0) e razão de AgNOR (0,09 vs. 0,17), respectivamente. Em conclusão, o sistema tegumentar auricular periférico de catetos possuiu algumas variações em relação a outros mamíferos, quanto ao número de camadas e espessura da epiderme, quantidade de células epidermais, melanócitos e parâmetros proliferativos. Além disso, 3,0 M de EG com 0,25 M de sacarose resultaram na melhor composição de crioprotetores na vitrificação de tecido somático de catetos / 2017-03-21