Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alexander_de_oliveira_goncalves.pdf: 291520 bytes, checksum: b6ebcc42cb32615e466fb7da14f76006 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The bovine in vitro embryo production (IVEP) showed a great expansion in last decades, but, various factors concours to low embryo production rates. This paper aimed to determine the influence of cryoprotector and sperm selection gradient on super recuperation rate and sperm integrity, including the rate of IVEP. The ejaculate of a bull with high FIV rates was divided; one part was frozen with 5% glycerol (GLY) and the other with 3% of ethylene glycol (EG). At sperm selection each group was centrifuged at 5000 x g/5min in discontinuous Percoll® (MP; 90 e 45%) and OptiPrep® (MO; 30 e 26%) mini gradients (600μl), forming four experimental groups: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Motility, agglutination, recuperation rate, membrane integrity (MI), acrosome integrity (AI) and mitochondrial activity (MA) were evaluated pre- and post-sperm selection. Embryo production rates were accessed at cleavage, D7 and D8. At thawing there was no difference (P>0,05) on sperm motility (GLY - 78.6% ± 6,9 and EG - 75.7%± 5,3) and no sperm agglutination was detected. After sperm selection motility and sperm recuperation were different (P<0,05) between the groups GLY/MP; EG/MP e GLY/OP; EG/OP (82.9 ± 7.6 e 46.5 ± 13.8; 81.4 ± 9,0 and 44.3 ± 16.3 vs. 27.1 ± 4.9 e 23.1 ± 7.4; 31,4 ± 6.9 e 29.8 ± 12.4, respectively). On the other hand, there were no difference (P>0,05) between groups in sperm structural integrity after thawing and after sperm selection. The cleavage rate of GLY/MP and EG/MP groups were higher (P<0,05) than GLY/OP and EG/OP (66.1 ± 8.1 e 60.6 ± 14.2 vs. 41.6 ± 7.9 e 48.5 ± 7.5, respectively). At D7 blastocyst rates of GLY/MP group was superior (P<0,05) than GLY/MO, but similar (P>0,05) to EG/MP group, which do not differ (P>0,05) from EG/MO. At this moment only EG/MO do not differ (P>0,05) from GLY/MO. EG/MP, EG/MO and GLY/MO groups presented similar (P>0,05) embryo production rates at D8. In conclusion, the cryoprotectant do not interfere in the evaluated sperm and embryo parameters, and Percoll® mini - gradient provided better embryo production rates than OptiPrep® mini-gradient. / A PIV de embriões bovinos é a biotécnica de reprodução assistida que apresentou o maior crescimento nas últimas décadas, entretanto, vários fatores podem concorrer no comprometimento dos resultados. Este trabalho objetivou determinar a influência do crioprotetor e do gradiente de seleção espermática sobre a recuperação e integridade dos espermatozoides e a taxa de PIV de embriões bovinos. Inicialmente, um ejaculado de um touro reconhecidamente eficiente na FIV foi dividido em duas frações, uma delas congelada com 5% de glicerol (GLI) e a outra com 3% de etilenoglicol (EG). No momento da seleção espermática, cada grupo foi centrifugado a 5000 x g/5min em mini gradientes descontínuos de Percoll® (MP; 90 e 45%) ou OptiPrep® (MO; 30 e 26%) usando o método de volume reduzido (600μl), constituindo quatro grupos experimentais: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Foram realizadas avaliações espermáticas pré e pós seleção espermática de motilidade, aglutinação, recuperação, integridade de membrana (IM), integridade de acrossoma (IA) e funcionalidade mitocondrial (FM). Com relação à produção embrionária, foram avaliados os parâmetros de clivagem, desenvolvimento embrionário no dia 7 (D7) e no dia 8 (D8). Na avaliação espermática ao descongelamento as taxas de motilidade observadas foram semelhantes (P>0,05) entre os grupos GLI (78,6 ± 6,9) e EG (75,7 ± 5,3). Nesse momento também não foi detectada aglutinação espermática nas amostras dos dois tratamentos. Pós-seleção espermática foi encontrada diferenças para motilidade e recuperação espermática entre os grupos, GLI/MP; EG/MP e GLI/OP; EG/OP (82,9 ± 7,6 e 46,5 ± 13,8; 81,4 ± 9,0 e 44,3 ± 16,3 vs. 27,1 ± 4,9 e 23,1 ± 7,4; 31,4 ± 6,9 e 29,8 ± 12,4, respectivamente). Não foram encontradas diferenças nas avaliações de integridade estrutural dos espermatozoides pósdescongelamento e pós-seleção espermática em nenhum dos grupos testados (P>0,05). Nas avaliações de produção embrionária os grupos GLI/MP e EG/MP foram superiores (P<0,05) para clivagem do que os grupos GLI/OP e EG/OP (66,1 ± 8,1 e 60,6 ± 14,2 vs. 41,6 ± 7,9 e 48,5 ± 7,5, respectivamente). No D7, as taxas de produção de blastocistos obtidas no grupo GLI/MP foram maiores (P<0,05) do que no GLI/MO, mas foram semelhantes (P>0,05) ao EG/MP, que por sua vez, não diferiu (P>0,05) do EG/MO. Neste momento, apenas o EG/MO não diferiu (P>0,05) do GLI/MO. No D8, os grupos EG/MP, EG/MO e GLI/MO foram semelhantes (P>0,05). Conclui-se que o crioprotetor utilizado no congelamento de sêmen não interfere em nenhuma das avaliações espermáticas e de desenvolvimento embrionário e que o método de seleção espermática usando o mini gradiente OptiPrep® afeta a motilidade e recuperação espermática proporcionando menor taxa de produção embrionária do que quando se utiliza o mini gradiente Percoll®.

Cryopreservation of fish semen is a key to optimization of reproductive management, the formation of germplasm bank and the development of genetic improvement programs. The success of this technique depends on the management and balance of several factors such as the collection, dilution, packaging, freezing and thawing. Tambaqui semen cryopreservation protocols have been developed using 0.5 mL straws on packaging. However, the high volumes of semen produced and the elevated taxes of fecundity are presented by this specie, it is necessary to use larger volume storage containers for application to large-scale production. The objective of this study was to establish a tambaqui semen cryopreservation protocol in large straw 4,0mL, from the definition of cryosolution, equilibration time and the best ratio between temperature and time semen thawing. The semen collected was diluted, packaged in large straws, frozen in liquid nitrogen which was conditioned in dry-shipper and stored in cryogenic cylinder at -196 °C. In the first experiment, different cryosolutions (M1 - 5% 5% methylglycol; M2 - 5% 5% methylglycol+ 5% egg yolk; M3 - 10% 5% methylglycol; M4 - 10% 5% methylglycol + 5% egg yolk; M5 - 15% 5% methylglycol; M6 - 15% de 5% methylglycol + 5% egg yolk) and three equilibration times (4, 20 and 40 minutes) were tested. In the second experiment, different relation between temperature and time thawing on sperm quality (30ºC for 50s - T1; 30ºC for 80s - T2; 60ºC for 25s - T3 e 60ºC for 40s - T4) were evaluated. In conclusion, this study showed that the ideal protocol for cryopreservation of tambaqui semen in large straw 4,0mL is made by diluting semen at a ratio of 1: 9 (v: v) in a medium composed of 5% methylglycol and 5% egg yolk. Both of them must have remained in contact with each other for 4 minutes until both were subjected to freezing in dry-shipper. The thawing of samples required to be performed in a water bath at 60 ° C for 25s. / A criopreservação de sêmen de peixes é uma ferramenta para a otimização do manejo reprodutivo, a formação de bancos de germoplasma e o desenvolvimento de programas de melhoramento genético. O sucesso dessa técnica depende do domínio e o equilíbrio de vários fatores que envolvem os processos de coleta, diluição, envase, congelamento e descongelamento. Protocolos de criopreservação sêmen de tambaqui já foram desenvolvidos utilizando palhetas de 0,5mL no envase, no entanto, o elevado volume de sêmen produzido e alta fecundidade da espécie sugere o armazenamento em recipientes de maior volume para a aplicação na produção em larga escala. Com isso, o objetivo do presente estudo foi estabelecer um protocolo de criopreservação seminal do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL, a partir da definição de um meio diluidor, tempo de equilíbrio e a melhor relação entre temperatura e o tempo de descongelamento do sêmen. O sêmen coletado foi diluído, envasado em macropalhetas, congelado em vapor de nitrogênio líquido no botijão dry-shipper e armazenadas em botijão criogênico a -196°C. No primeiro experimento, foram testadas diferentes composições do meio diluidor (M1 - 5% de metilglicol; M2 - 5% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M3 - 10% de metilglicol; M4 - 10% de metilglicol + 5% de gema de ovo; M5 - 15% de metilglicol; M6 - 15% de metilglicol + 5% de gema de ovo) e três tempos de equilíbrio (4, 20 e 40 minutos). No segundo experimento, foram avaliadas diferentes velocidades de descongelamento do sêmen em banho-maria, sobre a qualidade espermática (30ºC por 50s - T1; 30ºC por 80s - T2; 60ºC por 25s - T3 e 60ºC por 40s - T4). Ao final do estudo concluiu-se, que o protocolo ideal para a criopreservação do sêmen do tambaqui em macropalhetas de 4,0mL consiste na diluição do sêmen na proporção de 1:9 (v:v) em um meio composto por 5% de metilglicol e 5% de gema de ovo, os quais devem permanecer em contato por 4 minutos até que sejam submetidos ao processo de congelamento em botijão dry-shipper. O descongelamento das amostras deve ser realizado em banho-maria a 60°C por 25s.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-15T17:31:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ExpressaoGenicaViabilidade.PDF: 2527584 bytes, checksum: a92c30bb13a081c6f66b18e729cf04d0 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-19T14:44:20Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ExpressaoGenicaViabilidade.PDF: 2527584 bytes, checksum: a92c30bb13a081c6f66b18e729cf04d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-19T14:44:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_ExpressaoGenicaViabilidade.PDF: 2527584 bytes, checksum: a92c30bb13a081c6f66b18e729cf04d0 (MD5) Previous issue date: 2012-05-25 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A vitrificação é uma biotécnica que tem se mostrando cada vez mais promissora em várias espécies, dentre elas ruminantes domésticos (como ovelhas, cabras e vacas), e em primatas não humanos (PNH) (como o cynomologus e rhesus), e consiste na redução ultra-rápida da temperatura mediante a presença de altas concentrações de agentes crioprotetores (ACP’s) em nitrogenio liquido. Desta forma o objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de uma metodologia de criopreservação por vitrificação de Folículos Ovarianos Pré-antrais (FOPA’s) em Sapajus apella. Para tanto, foram utilizadas femêas (n=9) adultas de Sapajus apella pertencentes ao plantel do Centro Nacional de Primatas (CENP). Foram realizadas coletas de córtex de tecido ovariano por meio de laparotomia exploratória de modo a não inviabilizar o animal reprodutivamente. Os fragmentos expostos a 8 tratamentos diferentes: Etilenoglicol (EG) 40% + Sacarose (Sac) 0,5 M dissolvidos em TCM-199 adicionados ou não de Selenio (2,5, 5 ou 10 ng/ml) ou Trolox (25, 50 ou 100 mM). Após a exposição aos agentes crioprotetores foi analisada a viabilidade folicular antes e após a vitrificação, a partir da morfologia folicular, expressão dos genes Hsp70, Erp29, Erp60 e Sod1 através da análise por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), além de realizar a dosagem de estresse oxidativo atravéz da TEAC (do inglês Total Equivalent Antioxidant Activity). As análises mostraram que a vitrificação permitiu a manutenção da viabilidade folícular mediante a exposição previa a elevadas concentrações de ACP’s, principalmente quando suplementados com trolox a 50 μM (que resultou em elevadas taxas de sobrevivência folicular) e aumento na expressão da enzima antioxidante Sod1. Enquanto na ausência do mesmo foi observado o aumento nas taxas de folículos degenerados e com vacuolização citoplasmática, além da redução na expressão da enzima antioxidante Sod1 e elevação da expressão da chaperona Erp29. / Vitrification is a biotech that has been increasingly showing promise in several species, among them domestic ruminants (such as sheep, goats and cows) and in nonhuman primates (NHP) (as cynomologus and rhesus), and consists in reducing ultra-rapid temperature by the presence of high concentrations of cryoprotective agents (PCA's) in liquid nitrogen. Thus the aim of this study was to develop a methodology for cryopreservation by vitrification of preantral follicles (PF's) in Sapajus apella. For this purpose, we used females (n = 9) adult Sapajus apella squad belonging to the National Primate Center (CENP). Samples were taken from the ovarian cortex by laparotomy so as not to destabilize the animals reproducibly. The fragments exposed to 8 different treatments: Ethylene glycol (EG) + 40% Sucrose (Sac) dissolved in 0.5 M TCM-199, added to Selenium (2,5, 5 or 10 ng / ml) or Trolox (25, 50 or 100 mM). Following exposure to cryoprotective agents was analyzed follicular viability before and after vitrification, from the follicular morphology, expression of Hsp70 genes, Erp29, Erp60 SOD1 and through the analysis by Polymerase Chain Reaction (PCR), in addition to performing measurement of oxidative stress thru the TEAC (English Total Equivalent Antioxidant Activity). The analyzes showed that vitrification allowed the maintenance of follicular viability by previous exposure to concentrations of ACP's alevadas, especially when supplemented with 50 mM trolox (which resulted in high follicular survival rates) and increased expression of the antioxidant enzyme SOD1. While in the absence of it was observed an increase in rates of follicles degenerate and vacuolated, and reduced expression of the antioxidant enzyme SOD1 and increased expression of chaperone Erp29.