Chicken spermatozoa undergo a post-testicular maturation process similar to that reported for mammals. Association of secreted epididymal proteins and glycoproteins with the sperm surface appears to be complete at the anterior ductus deferens. However, antigenic change to, and glycosylation and deglycosylation of seminal plasma and sperm surface-associated proteins, selective loss of proteins from the sperm surface, as well as secretion of some seminal plasma proteins and selective absorption of others by epithelial cells lining the excurrent ducts, continues in the ductus deferens and ampulla. Hypertonic treatment or neuraminidase treatment of spermatozoa without apparent loss of sperm integrity in-vitro, reduced the ability of spermatozoa to gain access to the uterovaginal insemination. This indicates a clear role for sperm surface-associated proteains and sperm surfarce sialic acid in vaginal sperm transport. Sperm surface-associated proteins were also extracted by glycerol in a temperature-dependent and concentration-dependent manner. This was accompanied at room temperature by a glycerol concentration-dependent reduction in sperm motility. These effects may be implicated in the contraceptive action of glycerol in the chicken vagina. Spermatozoa from several avian and mammalian species entered quail uterovaginal junction SSTs in-vitro, and turkey spermatozoa were found in chicken uterovaginal junction SSTs following uterovaginal junction but not intravaginal insemination, thus showing that the SSTs are not selective, and identifying the vagina as a major site of oviducal sperm selection. Spermatozoa washed from the vagina following intravaginal insemination had immunoglobulin bound to their surface, which was shown to be associated with cell death. Spermatozoa recovered from the anterior oviduct however, were generally devoid of bound immunoglobulin. Furthermore, sperm access to the newly ovulated egg in-vivo following incubation with vaginal mucosa in-vitro did not differ significantly from that of control spermatozoa despite fewer viable spermatozoa inseminated, suggesting a true 'selection' of spermatozoa in the vagina. Ovarian pocket fluid, postulated to be the milieu in which fertilisation takes place in-vivo, altered sperm surface antigenicity and reduced sperm motility in-vitro, suggesting that spermatozoa may naturally undergo oviduct-induced changes prior to fertilisation. Sperm-egg interaction appears specific and receptor-mediated, as in mammals. Spermatozoa showed no preference for the animal pole of the egg, and heterologous gamete combinations indicated limited, order-dependent rather than species-dependent specificity. Presenting carbohydrate residues on the sperm surface and sperm surface antigenicity showed a lack of change proportional to species divergence, although the vagina clearly presents the main barrier to interspecies fertilisation within the order Galliformes.

Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alexander_de_oliveira_goncalves.pdf: 291520 bytes, checksum: b6ebcc42cb32615e466fb7da14f76006 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The bovine in vitro embryo production (IVEP) showed a great expansion in last decades, but, various factors concours to low embryo production rates. This paper aimed to determine the influence of cryoprotector and sperm selection gradient on super recuperation rate and sperm integrity, including the rate of IVEP. The ejaculate of a bull with high FIV rates was divided; one part was frozen with 5% glycerol (GLY) and the other with 3% of ethylene glycol (EG). At sperm selection each group was centrifuged at 5000 x g/5min in discontinuous Percoll® (MP; 90 e 45%) and OptiPrep® (MO; 30 e 26%) mini gradients (600μl), forming four experimental groups: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Motility, agglutination, recuperation rate, membrane integrity (MI), acrosome integrity (AI) and mitochondrial activity (MA) were evaluated pre- and post-sperm selection. Embryo production rates were accessed at cleavage, D7 and D8. At thawing there was no difference (P>0,05) on sperm motility (GLY - 78.6% ± 6,9 and EG - 75.7%± 5,3) and no sperm agglutination was detected. After sperm selection motility and sperm recuperation were different (P<0,05) between the groups GLY/MP; EG/MP e GLY/OP; EG/OP (82.9 ± 7.6 e 46.5 ± 13.8; 81.4 ± 9,0 and 44.3 ± 16.3 vs. 27.1 ± 4.9 e 23.1 ± 7.4; 31,4 ± 6.9 e 29.8 ± 12.4, respectively). On the other hand, there were no difference (P>0,05) between groups in sperm structural integrity after thawing and after sperm selection. The cleavage rate of GLY/MP and EG/MP groups were higher (P<0,05) than GLY/OP and EG/OP (66.1 ± 8.1 e 60.6 ± 14.2 vs. 41.6 ± 7.9 e 48.5 ± 7.5, respectively). At D7 blastocyst rates of GLY/MP group was superior (P<0,05) than GLY/MO, but similar (P>0,05) to EG/MP group, which do not differ (P>0,05) from EG/MO. At this moment only EG/MO do not differ (P>0,05) from GLY/MO. EG/MP, EG/MO and GLY/MO groups presented similar (P>0,05) embryo production rates at D8. In conclusion, the cryoprotectant do not interfere in the evaluated sperm and embryo parameters, and Percoll® mini - gradient provided better embryo production rates than OptiPrep® mini-gradient. / A PIV de embriões bovinos é a biotécnica de reprodução assistida que apresentou o maior crescimento nas últimas décadas, entretanto, vários fatores podem concorrer no comprometimento dos resultados. Este trabalho objetivou determinar a influência do crioprotetor e do gradiente de seleção espermática sobre a recuperação e integridade dos espermatozoides e a taxa de PIV de embriões bovinos. Inicialmente, um ejaculado de um touro reconhecidamente eficiente na FIV foi dividido em duas frações, uma delas congelada com 5% de glicerol (GLI) e a outra com 3% de etilenoglicol (EG). No momento da seleção espermática, cada grupo foi centrifugado a 5000 x g/5min em mini gradientes descontínuos de Percoll® (MP; 90 e 45%) ou OptiPrep® (MO; 30 e 26%) usando o método de volume reduzido (600μl), constituindo quatro grupos experimentais: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Foram realizadas avaliações espermáticas pré e pós seleção espermática de motilidade, aglutinação, recuperação, integridade de membrana (IM), integridade de acrossoma (IA) e funcionalidade mitocondrial (FM). Com relação à produção embrionária, foram avaliados os parâmetros de clivagem, desenvolvimento embrionário no dia 7 (D7) e no dia 8 (D8). Na avaliação espermática ao descongelamento as taxas de motilidade observadas foram semelhantes (P>0,05) entre os grupos GLI (78,6 ± 6,9) e EG (75,7 ± 5,3). Nesse momento também não foi detectada aglutinação espermática nas amostras dos dois tratamentos. Pós-seleção espermática foi encontrada diferenças para motilidade e recuperação espermática entre os grupos, GLI/MP; EG/MP e GLI/OP; EG/OP (82,9 ± 7,6 e 46,5 ± 13,8; 81,4 ± 9,0 e 44,3 ± 16,3 vs. 27,1 ± 4,9 e 23,1 ± 7,4; 31,4 ± 6,9 e 29,8 ± 12,4, respectivamente). Não foram encontradas diferenças nas avaliações de integridade estrutural dos espermatozoides pósdescongelamento e pós-seleção espermática em nenhum dos grupos testados (P>0,05). Nas avaliações de produção embrionária os grupos GLI/MP e EG/MP foram superiores (P<0,05) para clivagem do que os grupos GLI/OP e EG/OP (66,1 ± 8,1 e 60,6 ± 14,2 vs. 41,6 ± 7,9 e 48,5 ± 7,5, respectivamente). No D7, as taxas de produção de blastocistos obtidas no grupo GLI/MP foram maiores (P<0,05) do que no GLI/MO, mas foram semelhantes (P>0,05) ao EG/MP, que por sua vez, não diferiu (P>0,05) do EG/MO. Neste momento, apenas o EG/MO não diferiu (P>0,05) do GLI/MO. No D8, os grupos EG/MP, EG/MO e GLI/MO foram semelhantes (P>0,05). Conclui-se que o crioprotetor utilizado no congelamento de sêmen não interfere em nenhuma das avaliações espermáticas e de desenvolvimento embrionário e que o método de seleção espermática usando o mini gradiente OptiPrep® afeta a motilidade e recuperação espermática proporcionando menor taxa de produção embrionária do que quando se utiliza o mini gradiente Percoll®.

Submitted by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-09T19:43:53Z No. of bitstreams: 2 CECILIA ISABEL INES URQUIZA MACHADO PAVIN.pdf: 662363 bytes, checksum: ba4999290c4e1737856e3587e64e850d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Anselmo (marcos.anselmo@unipampa.edu.br) on 2016-09-09T19:44:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 CECILIA ISABEL INES URQUIZA MACHADO PAVIN.pdf: 662363 bytes, checksum: ba4999290c4e1737856e3587e64e850d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-09T19:44:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 CECILIA ISABEL INES URQUIZA MACHADO PAVIN.pdf: 662363 bytes, checksum: ba4999290c4e1737856e3587e64e850d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2016-08-05 / Os métodos de seleção espermática são utilizados com o objetivo de isolar uma maior população de espermatozoides morfologicamente melhor, além de permitir a capacitação destes, incrementando a taxa de embriões produzidos in vitro. Entre os métodos de seleção, o mais utilizado comercialmente na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos é o método de Gradiente Descontínuo de Percoll® (GDP). No entanto, apesar da praticidade desta técnica, a etapa de centrifugação é prejudicial, sendo responsável por danos estruturais as células espermáticas, bem como a diminuição da motilidade e da taxa de recuperação, interferindo assim, nas taxas de fecundação in vitro (FIV). Este estudo objetivou avaliar a centrifugação com amortecimento utilizando uma solução de iodixanol durante a seleção espermática para a PIV de embriões bovinos. No experimento I, o sêmen foi descongelado e dividido em quatro grupos, e os espermatozoides submetidos a separação espermática pelo método de GDP com ou sem a solução colóide; sendo o amortecimento testado na primeira (C1), segunda (C2) ou ambas centrifugações (C1-2). Em seguida, foram avaliadas a taxa de recuperação, a cinética espermática, e a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). No experimento II foi avaliada a taxa de fecundação e a cinética de desenvolvimento embrionário dos grupos C e C1, que foram os tratamentos que demonstraram os melhores resultados para a cinética espermática, taxa de recuperação e análise bioquímica no primeiro experimento. Neste estudo, o grupo com amortecimento obteve um aumento na taxa de fecundação e clivagem, quando comparado ao grupo controle (60,5 vs 48,55 e 80,0 vs 64,7%, respectivamente). Com base nestes resultados foi possível concluir que o uso de 9 uma solução de amortecimento durante a etapa de centrifugação para a seleção espermática permitiu a preservação da cinética e da integridade da membrana dos espermatozoides, sem reduzir a taxa de recuperação. Adicionalmente, foi demonstrado pela primeira vez que o uso da centrifugação com amortecimento incrementa, não apenas a taxa de fecundação e clivagem, mas também o número de embriões que clivam mais cedo. / In order to optimize bovine in vitro fertilization (IVF), sperm selection methods have been used to isolate sperm subpopulations with high fertilizing capacity for use in animal breeding. Among the methods of sperm selection, the most common method used is the Discontinuous Percoll® Gradients (DPG). However, again despite the practicality of this technique, the centrifugation step is harmful, accounting for structural damage in sperm and decrease in motility and sperm recovery rate, as well as interfering with in vitro fertilization rates. This study aimed to evaluate the cushioned centrifugation using an iodixanol solution on sperm selection for in vitro production (IVP) of bovine embryos. In experiment I, the thawed semen was divided into four groups and the sperm subjected to the separation method by discontinuous Percoll® gradients with and without a colloid solution, where the cushioning was tested in the first (C1), second (C2), and both centrifugations (C1-2). Then, the recovery rate, sperm kinetics, and production of reactive oxygen species (ROS) were evaluated. Experiment II evaluated the fertilization rate and embryonic development kinetics of C and C1 groups; who were the treatments that have shown the best results for motion kinetics, recovery rate, and biochemical analysis in Experiment I. In this assay, the group with cushioning obtained an increase in the fertilization and cleavage rate when compared with the control (60.5 vs 48.55 and 80.0 vs 64.7%, respectively). With this study, we can conclude that the use of a cushion solution during centrifugation on sperm selection had preserved the motion properties of spermatozoa and the 11 integrity of the sperm membrane without lowering the recovery rate. Furthermore, it was demonstrated for the first time that the use of cushioned centrifugation increases not only the cleavage rate but the number of embryos previously cleaved.

An integrated system combining a magnetically-driven micromotor and a synthetized protein-based hyaluronic acid (HA) microflake is presented for the in situ selection and transport of multiple motile sperm cells (ca. 50). The system appeals for targeted sperm delivery in the reproductive system to assist fertilization or to deliver drugs. The binding mechanism between the HA microflake and sperm relies on the interactions between HA and the corresponding sperm HA receptors. Once sperm are captured within the HA microflake, the assembly is trapped and transported by a magnetically-driven helical microcarrier. The trapping of the sperm-microflake occurs by a local vortex induced by the microcarrier during rotation-translation under a rotating magnetic field. After transport, the microflake is enzymatically hydrolyzed by local proteases, allowing sperm to escape and finally reach the target location. This cargo-delivery system represents a new concept to transport not only multiple motile sperm but also other actively moving biological cargoes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is becoming a current issue in animal reproduction biotechnology due to economical reasons. Predetermining the sex of offspring is one example of PGD. This study aimed to determine the percentage of male and female bovine embryos in vitro produced after oocyte fertilization with Percoll density gradient centrifugation or with self-migration (swim-up) selected semen. In experiment 1, sperm selection was performed by 90%-45% discontinuous Percoll density gradient centrifugation (T1) and swim-up (T2). In experiment 2, along side the discontinuous gradient, a 67.5% continuous density gradient, and centrifugation time of 5 and 10 minutes were used. A total of 4 treatment groups was defined (TI = continuous, 5 minutes, TII = discontinuous, 5 minutes, TIII = continuous, 10 minutes and TIV = discontinuous, 10 minutes). Polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the sex of the embryos. T1 (n=185) resulted in 48.65% (n=90) male embryos and 51.35% (n=95) female embryos and T2 (n=142) in 58.45% (n=83) male and 41.55% (n=59) female embryos. In experiment 2, the percentages of male and female embryos obtained in TI (n=93), TII (n=70), TIII (n=82) and TIV (n=82) were 49.46% (n=46) and 50.54% (n=47), 57.14% (n=40) and 42.86% (n=30), 36.59% (n=30) and 63.41% (n=52) and 48.78% (n=40) and 51.22% (n=42), respectively. There was no difference on the percentage of males and females in all treatment groups from experiments 1 and 2 when these were individually compared to the expected percentage of 50% of each sex. There was also no difference in male and female embryo percentage between treatment groups in experiments 1 and 2. / O diagnóstico genético pré-implantação (DGP) vem se destacando na área da biotecnologia da reprodução animal por motivos econômicos. Um exemplo de DGP é a predeterminação do sexo da prole. Neste estudo foi verificada a percentagem de embriões bovinos machos e fêmeas produzidos in vitro após a fertilização de oócitos com sêmen selecionado por centrifugação em gradiente de densidade de Percoll ou por migração ascendente (swim-up). No experimento 1 a seleção espermática foi realizada usando o gradiente descontínuo de Percoll de 90% e 45% (T1) e o swimup (T2). No experimento 2 foi utilizado, além do gradiente descontínuo, um gradiente contínuo de densidade de Percoll de 67,5%, e tempos de centrifugação de 5 e 10 minutos, totalizando 4 tratamentos (TI = contínuo 5 minutos, TII = descontínuo 5 minutos, TIII = contínuo 10 minutos e TIV = descontínuo 10 minutos). A sexagem dos embriões foi realizada através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). No T1 (n=185) foram obtidos 48,65% (n=90) de embriões masculinos e 51,35% (n=95) de femininos e no T2 (n=142) 58,45% (n=83) foram machos e 41,55% (n=59) fêmeas. No experimento 2, a percentagem de embriões masculinos e femininos no TI (n=93), TII (n=70), TIII (n=82) e TIV (n=82) foi de 49,46% (n=46) e 50,54% (n=47), 57,14% (n=40) e 42,86% (n=30), 36,59% (n=30) e 63,41% (n=52), e 48,78% (n=40) e 51,22% (n=42), respectivamente. Não houve alteração na percentagem de machos e fêmeas nos tratamentos dos experimentos 1 e 2 quando estes tratamentos foram comparados individualmente com a percentagem teoricamente esperada de 50% de cada sexo. Também não houve alteração na percentagem de machos e fêmeas na comparação entre os dois tratamentos do experimento 1 e entre os quatro tratamentos do experimento 2.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_liziane_vianna.pdf: 321138 bytes, checksum: e8e76002b27c6cb6d710d3cd63a4c088 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The objective of this study was to evaluate alternative methods to the gradient of Percoll® for sperm selection used in bovine in vitro production systems. We evaluated the following parameters: sperm quality, embryo development, the viability after cryopreservation and sex ratio of bovine embryos produced in vitro. Four treatments were performed: percoll group (90 and 45%) 4 mL, centrifuged at 700xg for 20 min; minipercoll group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; miniisolate group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; and minioptiprep group (30,28 and 26%) 1,2 mL, centrifuged at 900xg for 15 min. Different gradients did not affect the semen characteristics compared with the evaluation immediately after thawing (P>0,05). It was only observed a decrease in total motility in minioptiprep group (P<0,05). The cleavage rates were similar among the percoll and miniisolate groups (P>0,05). Minipercoll and minioptiprep groups were lower to percoll (P<0,05) and similar to isolate (P>0,05). At Day 7 the developmental rates were higher in miniisolate group than other groups (P<0,05). But at D8 the developmental rates of minigradients were similar to percoll (P>0,05). Among the minigradientes, the miniisolate was higher to minipercoll and minioptiprep (P<0,05). The treatments did not affect the sex ratio expected of 50:50% (P.0,05) and there was no difference among the four groups (P>0,05). Also, there was no difference in survival rates after vitrification (P>0,05). In conclusion, the miniisolate and the minioptiprep groups, in the concentration and volume used in our experiment, reached similar results to the percoll group. So, they are alternatives to the gradient of Percoll® in the routine of IVP bovine embryos. / O objetivo do presente estudo foi avaliar possíveis alternativas ao gradiente de Percoll®, para seleção espermática, no sistema de produção in vitro de embriões bovinos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: qualidade espermática, desenvolvimento embrionário, viabilidade após a criopreservação e a proporção sexual dos embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados quatro tratamentos: grupo percoll (90 e 45%) - 4 mL, centrifugado 700xg por 20 min; grupo minipercoll (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; gupo miniisolate (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; e grupo minioptiprep (30, 28 e 26%) - 1,2 mL, centrifugado a 900xg por 15 min. A passagem pelos gradientes não afetou as características do sêmen em comparação com a avaliação realizada logo após o descongelamento (P>0,05), sendo somente observada uma diminuição da motilidade total para o grupo minioptiprep (P<0,05). Quanto a produção in vitro de embriões, não foi observada diferença na taxa de clivagem entre os grupos percoll e miniisolate (P>0,05), sendo o minipercoll e o minioptiprep inferiores ao percoll (P<0,05) e semelhantes ao miniisolate (P>0,05). No desenvolvimento embrionário, o miniisolate foi superior aos demais grupos em D7 (P<0,05). Em D8, os três minigradientes foram semelhantes ao percoll (P>0,05). Entre os minigradientes, o miniisolate foi superior ao minipercoll e ao minioptiprep (P<0,05). A passagem pelos gradientes não afetou a proporção sexual esperada de 50:50%, além disso, não houve diferença entre os grupos (P>0,05). Não houve diferença quanto à taxa de sobrevivência a vitrificação nos quatro grupos em 48 h (P>0,05). Concluímos que o miniisolate e o minioptiprep, nas concentrações e volumes estudados neste trabalho, atingiram resultados semelhantes ao percoll. Portanto, são alternativas a utilização do gradiente de Percoll®, na rotina de produção de embriões bovinos in vitro.