Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

Estudos recentes avaliaram o papel do Magnetic Activated cell Sorting (MACS, separação celular por ativação magnética) para reduzir a percentagem de espermatozoides apoptóticos e melhorar a qualidade seminal. No entanto, a eficiência do uso do MACS isoladamente, antes ou depois do processamento seminal pelos métodos clássicos, como o centrifugação em gradiente de densidade (DGC), ainda não foi estabelecida, de modo que o protocolo de uso do método não foi adequadamente estabelecido. Desta forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar se o MACS sozinho, antes (MACS-DGC) ou depois do processamento seminal pelo DGC (DGC-MACS) melhora a seleção espermática quando comparado ao processamento pelo DGC. Realizou-se um estudo prospectivo experimental avaliando amostras de sêmen de 15 homens saudáveis. A mesma amostra foi dividida em 4 alíquotas e processada por: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC e MACS. Após o processamento, foram analisadas a integridade do DNA espermático pelo método TUNEL - TdT-mediated dUTP Nick End Labeling (marcação de quebras no DNA por dUTP e deoxinucleotidil terminal transferase) assim como a concentração de espermatozoides, a motilidade progressiva e a morfologia, segundo os últimos critérios adotados pela Organização Mundial da Saúde. A percentagem de dano ao DNA foi significativamente menor no grupo MACSDGC, quando comparado com DGC e MACS, e semelhante a do grupo DGC-MACS. A concentração de espermatozoides recuperados nos grupos de DGC e MACS foi similar e significativamente maior do que MACS-DGC e DGC-MACS, que foram semelhantes entre si. A motilidade progressiva dos espermatozoides recuperados foi semelhante nos grupos MACS-DGC e DGC e significativamente maior do que nos grupos DGC-MACS e MACS. O percentual de espermatozoides com morfologia normal foi significativamente maior no grupo MACS-DGC quando comparado ao DGC-MACS e MACS, e semelhante quando comparado com DGC. Desta forma, evidenciou-se que ambos os métodos combinados promovem a recuperação de espermatozoides com menor percentagem de dano ao DNA espermático. O MACS isoladamente ou aplicado após o DGC promove redução significativa dos espermatozoides progressivos recuperados, assim como da percentagem de espermatozoides com morfologia normal. Todavia, o MACS aplicado antes do DGC promove a recuperação de amostras com elevada percentagem de espermatozoides com motilidade progressiva e morfologia normal, aliada a baixa percentagem de DNA fragmentado, sugerindo ser o melhor protocolo de uso desta metodologia, cuja importância clínica precisa ser avaliada em estudos clínicos bem delineados. / Recent studies evaluated the role of Magnetic Activated Cell Sorting (MACS) in order to reduce the percentage of apoptotic sperm and improve seminal quality. However, the effectiveness of using MACS alone, before or after seminal processing by classical methods, such as the density gradient centrifugation (DGC), has not yet been established. Thus, the role of the present study was evaluate whether: MACS alone, before (MACS-DGC) or after seminal processing by DGC (DGC-MACS) improves sperm selection when compared to DGC. A prospective experimental study was conducted evaluating semen samples from 15 healthy men. The same sample was divided into 4 aliquots and processed by: DGC, DGC-MACS, MACS-DGC and MACS. After processing, the integrity of the sperm DNA was analyzed by TUNEL - TdT - mediated dUTP method Nick End Labeling (marking DNA breaks by dUTP and deoxynucleotidyl terminal transferase), sperm concentration, progressive motility and morphology according to the last criteria adopted by the World Health Organization. The percentage of DNA damage was significantly lower in the MACS-DGC group, when compared to DGC and MACS, and similar to the DGC-MACS group. The concentration of spermatozoa recovered in the DGC and MACS groups was similar and significantly higher than MACS-DGC and DGC-MACS, which were similar to each other. The progressive motility was similar in the MACS-DGC and DGC groups and significantly higher than in the DGC-MACS and MACS groups. The percentage of spermatozoa with normal morphology was significantly higher in the MACS-DGC group when compared to DGC-MACS and MACS, and similar when compared to DGC. Thus, it was evidenced that both methods combined promote the recovery of spermatozoa with a lower percentage of DNA damage. MACS alone or applied after the DGC promotes a significant reduction of the progressive sperm retrieved, as well as the percentage of spermatozoa with normal morphology. However, the MACS applied before the DGC promotes the recovery of samples with a higher percentage of spermatozoa with progressive motility and normal morphology, combined with low percentage of fragmented DNA, suggesting to be the best protocol, whose clinical importance needs to be evaluated in well-delineated clinical studies.

Made available in DSpace on 2016-12-12T20:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGEF14MA015.pdf: 271974 bytes, checksum: ebd1c9622a65b4e8b500be551ca4bc58 (MD5) Previous issue date: 2014-06-26 / The objective of this work to determine effective treatment for breaking dormancy of seeds of Ocotea puberula, check the behavior of the seed during drying and storage and evaluate the appropriate method for detecting pathogens, asepsis, seeds prior to detection of pathogens and genera of fungi which infest seeds of this species. The seeds were collected in five counties of the State of Santa Catarina (Fraiburgo Joaçaba, Curitibanos, Ponte Alta and Brunópolis), and each collection site was considered a lot. To break dormancy were tested four treatments: 1- control, 2- seeds without tegument; 3- sulfuric acid for 5 minutes and 4- drying the seeds at 25 °C for 12 hours. After performing the tests break dormancy, seeds were subjected to germination test gerboxes substrate with blotting paper in BOD at 30 oC with 4 replicates of 20 seeds per treatment/lot. Regarding the types of drying seeds with an initial moisture content of 38% was dried to 18% with gradient of 2% in oven (35 °C) in a desiccator with silica gel (25 °C). After drying, was determined the water content and viability (tetrazolium and germination tests). In the armazenament study, the seeds were stored with and without fruit, in a dry camera (40% RH and Temp. 10 ± 2 oC) for periods of 0, 3, 6 and 9 months. At each time interval were determined water content and the viability of the seeds by germination, tetrazolium and DNA integrity testing. Determination of seed health was held in PDA culture medium, medium culture V8 and "Blotter Test". In each test were used seeds With and without disinfection (disinfection with sodium hypochlorite and alcohol) totaling 80 seeds for each test. Incubation of seeds was realized in a chamber with controlled temperature of 22 °C ± 3 °C, with a photoperiod of 12 hours for seven days when the assessment and identification of fungi occurred. It was observed that seeds without tegument started germination after 14 days of the start of the test, with stabilizing stand at 36 days, with average scores of 71% germination. Not was observed seed germination for other treatments and control in all lots used. Regarding drying, it was observed that up to 32% humidity no change in seed quality, regardless of the type of drying and verified significant loss of germination after this value. Seeds of Ocotea puberula lost their viability after 3 months of storage, with or without fruit. Nine genera of fungi were observed: Penicillium sp., Phomopsis sp., Epicocum sp., Curvularia sp., Colletotrichum sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Fusarium sp. and Trichoderma sp.. It was concluded that the method of seed coat removal was effective in breaking dormancy of seeds of Ocotea puberula and the type of drying does not affect the quality of the seed; however, reducing the water content below 32% decreased germination. Seeds of Ocotea puberula lose their viability after 3 months of storage in dry chamber and agarized media were more sensitive for the detection of fungi in weed seeds and seed disinfection with sodium hypochlorite and alcohol reduces the incidence of these fungi, is indicated when sanity test is performed with seeds of this species / Objetivou-se com este trabalho determinar tratamento eficiente para superação de dormência de sementes de Ocotea puberula, verificar o comportamento das sementes durante a secagem e o armazenamento e avaliar o método adequado para detecção de patógenos, da assepsia, das sementes antes da detecção dos patógenos e quais gêneros fúngicos infestam sementes desta espécie. As sementes foram colhidas em cinco municípios do Estado de Santa Catarina (Fraiburgo, Joaçaba, Curitibanos, Ponte Alta e Brunópolis), e cada local de coleta foi considerado um lote. Para a superação da dormência, foram testados quatro tratamentos: 1- testemunha, 2- sementes sem o tegumento; 3- ácido sulfúrico por 5 minutos e 4- secagem das sementes a 25 oC por 12 horas. Após a realização dos testes de superação da dormência, as sementes foram submetidas ao teste de germinação em caixas gerbox com substrato de papel mata borrão, em BOD a 30 oC, com 4 repetições de 20 sementes por tratamento/lote. Em relação aos tipos de secagem, sementes com teor de água inicial de 38% foram secas até 18%, com gradientes de 2%, em estufa (35 ºC) e em dessecador com sílica-gel (25 ºC). Após cada secagem, foram determinados o teor de água e a viabilidade (testes de tetrazólio e germinação). No estudo de armazenamento, as sementes foram armazenadas com e sem fruto, em câmara seca (UR 40% e Temp. 10 ± 2 oC), pelos períodos de 0, 3, 6 e 9 meses. A cada intervalo de tempo, foram determinados o teor de água e a viabilidade das sementes, pelos testes de germinação, tetrazólio e a integridade do DNA. A determinação da sanidade das sementes foi realizada em meio de cultura BDA, meio de cultura V8 e Blotter Test . Em cada teste, foram utilizadas sementes com e sem assepsia (desinfestação com hipoclorito de sódio e álcool), totalizando 80 sementes para cada teste. A incubação das sementes foi realizada em câmara com temperatura controlada a 22 °C ±3 oC, com fotoperíodo de 12 horas, durante sete dias, quando ocorreu a avaliação e identificação dos fungos. Foi observado que sementes sem o tegumento iniciaram a germinação após 14 dias do início do teste, com estabilização do estande aos 36 dias, com resultados médios de 71% de germinação. Não foi observada germinação para sementes dos demais tratamentos e testemunha, em todos os lotes utilizados. Em relação à secagem, foi observado que até 32% de umidade não houve alteração na qualidade das sementes, independente do tipo de secagem, sendo verificada significativa perda de germinação após esse valor. Sementes de Ocotea puberula perderam sua viabilidade após 3 meses de armazenamento, com ou sem fruto. Foram observados nove gêneros fungícos: Penicillium sp., Phomopsis sp., Epicocum sp., Curvularia sp., Colletotrichum sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Fusarium sp. e Trichoderma sp. Conclui-se que o método de retirada do tegumento foi eficiente na superação da dormência de sementes de Ocotea puberula e que o tipo de secagem não influencia na qualidade dessas sementes; porém, a redução do teor de água abaixo de 32% prejudica a germinação. Sementes de Ocotea puberula perdem sua viabilidade após 3 meses de armazenamento em câmara seca e os meios agarizados foram mais sensíveis para a detecção de fungos infestantes nas sementes e a assepsia das sementes com hipoclorito de sódio e álcool reduz a incidência desses fungos, sendo indicada quando se realiza teste de sanidade com sementes dessa espécie