Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-31Bitstream added on 2014-06-13T19:33:22Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_me_jabo.pdf: 498660 bytes, checksum: f8a6a9a504926a49d1926ba32ce8e61e (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A produção de doses de sêmen, enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X ou Y, aumentará a contribuição da inseminação artificial para: o incremento do progresso genético, produtividade e retorno econômico nas atividades pecuárias, e para a prevenção de doenças ligadas ao cromossomo X, na espécie humana. Constituiu objetivo do presente trabalho: aplicar o método de “swim-up” associado à centrifugação em gradiente descontínuo de densidade para produzir amostras de sêmen enriquecidas com espermatozóides portadores do cromossomo X, em bovinos. Após os tratamentos, os espermatozóides foram submetidos ao controle de qualidade pela avaliação da integridade acrossomal e taxas de produção de embriões in vitro. A validação dos resultados foi feita pela análise da proporção sexual dos embriões produzidos in vitro através da amplificação de uma seqüência específica do cromossomo Y presente no genoma bovino. Após a análise dos resultados observouse que não houve diferença significativa (P>0,05) no desvio da proporção sexual quando comparamos o grupo controle (45,20% de fêmeas) com os procedimentos de separação de espermatozóides (60,65% de fêmeas, em média). Os métodos de separação de espermatozóides, não prejudicaram a fertilidade dos espermatozóides (taxas de clivagem e blastocistos, em média, de 70% e 26% respectivamente). Este pode ser considerado um procedimento a ser utilizado na PIV de embriões bovinos. / The production of doses of semen enriched with X- and Y- bearing spermatozoa will increase the artificial insemination contribution for genetic progress, productivity and economic return in livestock production and prevention of diseases connected to X chromosome, in humans. The purpose of this work was associated the modified swimup method with the centrifugation in density gradient for separation of X-bearing spermatozoa. Quality control of centrifuged spermatozoa were evaluated by acrosomal integrity and in vitro embryo production. The results were validated by sex proportion of in vitro produced embryos using PCR by Y- specific sequences present in bovine male genomic DNA. After the determination of genetic sex of in vitro produced embryos, the results showed no statistical difference (P>0.05) on deviation of sex ratio when the control group (45.20% female) was compare with the others spermatozoa selection procedures (60.65% female). The spermatozoa selection methods didn’t impair fertility of X-bearing spermatozoa (cleavage and blastocyst rates: 70% and 26%, respectively) and would be considered methods of relevance to be introduced on in vitro produced embryos programs.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-11-09Bitstream added on 2014-06-13T20:06:41Z : No. of bitstreams: 1 resende_mv_dr_jabo.pdf: 538919 bytes, checksum: d1d1f8a0fcb5f27271577eeee85d5b38 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os objetivos deste trabalho foram de facilitar os procedimentos de formação de gradientes de- densidade de Percoll e OptiPrep para separação de espermatozóides X; avaliar a eficiência da sexagem de espermatozóides X, a viabilidade espermática e integridade do acrossoma e do DNA após a centrifugação nestes gradientes e avaliar taxa de clivagem e blastocisto durante a produção in vitro de embriões. Para isso, doses de sêmen de touros foram descongeladas e cerca de 40 milhões de espermatozóides foram colocados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas que variaram entre 1.11 Og/mL a 1.123g/mL em tubos de poliestireno de 15mL. Centrifugou-se o gradiente a 500xg por 15 min a 22°C. Os sobrenadantes foram aspirados e recuperados para verificação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, fragmentação do DNA, produção in vitro de embriões, avaliação da eficiência da sexagem pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e sexagem dos embriões pela PCR. A porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto diminuiu (P<0,05) após a centrifugação nos gradientes de densidade, mas não influenciou, de modo geral, a produção in vitro de embriões (taxa de clivagem e blastocistos) utilizando estes espermatozóides centrifugados. Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozóides nas amostras centrifugadas. Os resultados demonstraram que o Percoll enriqueceu as amostras com espermatozóides X (62% de fêmeas, P<0,05). No OptiPrep e grupo Controle a porcentagem de fêmeas foi de 47,1 e 48,7%, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA dos espermatozóides, com uma subestimação apenas no Percoll. Foi possível realizar a sexagem, por uma metodologia mais simples, facilitando o procedimento de centrifugação em gradiente de densidade e sem provocar danos aos espermatozóides. / The objectives of this work were to facilitate the procedures of formation of density gradients of Percoll and OptíPrep for separation of X-bearing bovine spermatozoa; to evaluate the efficiency of sexing and viability of acrosome integrity and DNA after centrifugation in these gradients and to assess the cleavage and blastocyst rate during in vitro production of embryos. For this, frozen-thawed spermatozoa (20 to 40 millions) were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers that varied between 1.110g/mL to 1.123g/mL, in 15mL polystyrene tubes. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 min at 22oC. Supernatants were carefully aspirated and sediments recovered for verification of sperm quality, DNA fragmentation, in vitro fertilization of embryos, evaluation of the efficiency of sexing by real time polymerase chain reaction (qPCR) and sexing of embryos by PCR. Percentage of live spermatozoa with intact acrosome decreased (P<0.05) after centrifugation in density gradients, however, it not influence, in general, the production of embryos in vitro (cleavage and blastocyst rates) using these centrifuged sperm. No sperm DNA fragmentation was detected in centrifuged samples. The results of embryo sexing by PCR showed deviation to female in the Percoll group (62%, P<0.05). In the OptiPrep and Control group the percentage of females was 47.1 and 48.7%, respectively. These results were confirmed by qPCR of DNA of spermatozoa, with an underestimation only in the Percoll group. It was possible the sexing, by a simple approach, facilitating the process of the centrifugation in density gradient and without damage to sperm.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-20Bitstream added on 2014-06-13T18:39:05Z : No. of bitstreams: 1 perini_ap_me_jabo.pdf: 340824 bytes, checksum: 06eec48bbcaca721eb390ec701442f6b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O presente trabalho teve como objetivos separar os espermatozóides portadores do cromossomo X viáveis, dos portadores do Y, através de gradiente descontínuo de densidade de PercollTM. Utilizar esse sêmen na produção in vitro de embriões bovinos, substituindo o SFB pela BSA no cultivo. Congelar estes embriões pelo método da congelação lenta. Avaliar a criotolerância dos embriões do sexo feminino pela taxa de eclosão e a eficiência do gradiente pela técnica da PCR, que identificou o sexo dos embriões produzidos. Foram produzidos 133 embriões do tratamento sexado (embriões produzidos a partir de sêmen submetido ao gradiente de densidade de PercollTM) e 100 do tratamento controle (embriões produzidos de acordo com o protocolo utilizado no departamento de Reprodução Animal). Após congelação, descongelação e cultivo destes embriões apenas 8 eclodiram do tratamento sexado e também 8 do tratamento controle, a análise estatística deste resultado demonstrou que o sexo não influenciou na taxa de eclosão pós descongelação. Porém a análise estatística dos embriões produzidos com sêmen sexado e submetidos a PCR demonstrou que o gradiente de densidade de PercollTM foi eficaz na separação dos espermatozóides X viáveis em 62%. / The present study had as purposes to separe X and Y sperm by PercollTM descontinuous density gradient. Use the semen on in vitro production bovine embryos, replacing the BFS for BSA on the culture. To freezing the embryos by the slow curve method. Evaluate the female embryos cryotolerance by eclosion rate and the gradient eficience by PCR technique that identify the embryos sex. 133 embryos were produced by the sexed treatment and 100 by control treatment. After freezing, unfreezing and culture of the embryos, only 8 ecloded of each treatment, the result statistics analyses showed that the sex had no influence on the eclosion rate after unfreeze. However the statistics analyses of the sexed semen produced embryos and submitted to PCR showed that the PercollTM density gradient was efficient on the viable X separation sperm in 62%.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-22Bitstream added on 2014-06-13T20:19:17Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_lz_me_jabo.pdf: 560786 bytes, checksum: c8f1ff167a93ccb809fee9a007e2147b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Algumas avaliações da capacidade de fecundação como a produção in vitro de embriões (PIV) e a coloração vital indicam que a sexagem de espermatozóides por centrifugação em gradiente de densidade pode causar diminuição nas taxas de desenvolvimento embrionário, entretanto, não são conclusivas quanto à avaliação da integridade das membranas espermáticas. Com o intuito de obter dados mais precisos em relação à viabilidade espermática pós-sexagem, foram descongeladas doses de sêmen de 6 touros diferentes, e avaliadas quanto aos danos espermáticos causados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll (com densidade variando de 1,111g/mL a 1,123g/mL). Antes e após a centrifugação dos espermatozóides, além das avaliações de concentração, motilidade e morfologia, o sêmen foi ainda avaliado quanto à integridade das membranas plasmáticas, acrossomal e mitocondrial pela associação das sondas fluorescentes: Iodeto de Propídio (PI), aglutinina de Pisum Sativum conjugado a Isotiocianato de flurosceína (FITC-PSA) e Iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro- 1,1,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1). Os resultados demonstraram que o processo de separação de espermatozóides X e Y por centrifugação em gradiente de densidade promoveu uma melhora nas características associadas à motilidade progressiva, além de uma significativa diminuição na incidência de defeitos maiores. Ainda nas amostras pós-centrifugação, foi observado um aumento no percentual de células com Membrana Plasmática Intacta e com Alto Potencial Mitocondrial. No entanto, o percentual de células com Membrana Acrossomal Intacta foi sensivelmente diminuída provavelmente devido ao fenômeno de reação acrossomal desencadeado pela centrifugação. / Some fecundity evaluations as the in vitro embryo production (IVP) and the vital stains have indicating that the density gradients centrifugation techniques can reduce the embryo development rates. However they are not conclusive for the integrity of spermatic membranes. Wit the purpose of obtain more precise sperm viability data after the sexing procedure, frozen semen samples from six different bulls were thawed and assessed for spermatic damage caused by centrifugation in discontinuous Percoll gradient (with density varying from 1,111g/mL to 1,123g/mL). Before and after the separation of X-bearing bovine sperm, were evaluated the sperm concentration, motility and morphology. Moreover the semen samples were assessed for integrity of plasma, acrosome and mitochondrial membranes by fluorescent probes association: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate–Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). The results demonstrated that the X-bearing sperm separation process by density gradient centrifugation caused an increase in the progressive motility parameters and a decrease in the major defects incidence. In addition, it was observed an increase in the cells categories with Intact Plasma Membrane and High Mitochondrial Membrane potential in the post-centrifugation samples. Nevertheless, the percentage of cells with Intact Acrossome Membrane was reduced probably due to the acrosome reaction phenomenon induced by centrifugation.

Este trabalho teve por finalidade simular a hidrodinâmica da Plataforma Continental Interna do Estado de São Paulo (PCISP) e da Plataforma Continental Média do Estado de São Paulo (PCMSP) no período de verão, em resposta às forçantes do gradiente de densidade, do vento climatológico e das marés, através da implementação do modelo numérico hidrodinâmico tridimensional Regional Ocean Modeling System (ROMS). Os experimentos realizados mostraram que os efeitos da distribuição de densidade sobre o comportamento geral da circulação na PCISP e PCMSP são secundários quando comparados à circulação induzida pela tensão de cisalhamento do vento. Os resultados apontam que na PCISP e na PCMSP a componente de velocidade paralela à costa é dominada por forçantes de frequência subinercial, como o vento climatológico e o gradiente de densidade, enquanto que a componente normal, na direção normal à costa, é fortemente influenciada pela forçante de maré. / The aim of this study was simulate the hydrodynamic of the Inner Continental Shelf of the State of São Paulo (PCISP) and of the Mid Continental Shelf of the State of São Paulo (PCMSP) during summer, in response to the density gradient forcing, to the climatological wind shear stress forcing and to the tide forcing, applying the tridimensional hydrodynamic numeric model Regional Ocean Modeling System (ROMS). The experiments performed showed the effects of the density distribution over the general circulation behavior in the PCISP and PCMSP are secondary compared with the induced climatological wind shear stress circulation. The results indicate that in the PCISP and in the PCMSP the component velocity parallel to the coast is dominated by subinertial frequencies forcing, as the climatological wind and the density gradient, while the component velocity perpendicular to the coast is strongly influenced by the tide forcing.

Este trabalho teve por finalidade simular a hidrodinâmica da Plataforma Continental Interna do Estado de São Paulo (PCISP) e da Plataforma Continental Média do Estado de São Paulo (PCMSP) no período de verão, em resposta às forçantes do gradiente de densidade, do vento climatológico e das marés, através da implementação do modelo numérico hidrodinâmico tridimensional Regional Ocean Modeling System (ROMS). Os experimentos realizados mostraram que os efeitos da distribuição de densidade sobre o comportamento geral da circulação na PCISP e PCMSP são secundários quando comparados à circulação induzida pela tensão de cisalhamento do vento. Os resultados apontam que na PCISP e na PCMSP a componente de velocidade paralela à costa é dominada por forçantes de frequência subinercial, como o vento climatológico e o gradiente de densidade, enquanto que a componente normal, na direção normal à costa, é fortemente influenciada pela forçante de maré. / The aim of this study was simulate the hydrodynamic of the Inner Continental Shelf of the State of São Paulo (PCISP) and of the Mid Continental Shelf of the State of São Paulo (PCMSP) during summer, in response to the density gradient forcing, to the climatological wind shear stress forcing and to the tide forcing, applying the tridimensional hydrodynamic numeric model Regional Ocean Modeling System (ROMS). The experiments performed showed the effects of the density distribution over the general circulation behavior in the PCISP and PCMSP are secondary compared with the induced climatological wind shear stress circulation. The results indicate that in the PCISP and in the PCMSP the component velocity parallel to the coast is dominated by subinertial frequencies forcing, as the climatological wind and the density gradient, while the component velocity perpendicular to the coast is strongly influenced by the tide forcing.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is becoming a current issue in animal reproduction biotechnology due to economical reasons. Predetermining the sex of offspring is one example of PGD. This study aimed to determine the percentage of male and female bovine embryos in vitro produced after oocyte fertilization with Percoll density gradient centrifugation or with self-migration (swim-up) selected semen. In experiment 1, sperm selection was performed by 90%-45% discontinuous Percoll density gradient centrifugation (T1) and swim-up (T2). In experiment 2, along side the discontinuous gradient, a 67.5% continuous density gradient, and centrifugation time of 5 and 10 minutes were used. A total of 4 treatment groups was defined (TI = continuous, 5 minutes, TII = discontinuous, 5 minutes, TIII = continuous, 10 minutes and TIV = discontinuous, 10 minutes). Polymerase chain reaction (PCR) was used to determine the sex of the embryos. T1 (n=185) resulted in 48.65% (n=90) male embryos and 51.35% (n=95) female embryos and T2 (n=142) in 58.45% (n=83) male and 41.55% (n=59) female embryos. In experiment 2, the percentages of male and female embryos obtained in TI (n=93), TII (n=70), TIII (n=82) and TIV (n=82) were 49.46% (n=46) and 50.54% (n=47), 57.14% (n=40) and 42.86% (n=30), 36.59% (n=30) and 63.41% (n=52) and 48.78% (n=40) and 51.22% (n=42), respectively. There was no difference on the percentage of males and females in all treatment groups from experiments 1 and 2 when these were individually compared to the expected percentage of 50% of each sex. There was also no difference in male and female embryo percentage between treatment groups in experiments 1 and 2. / O diagnóstico genético pré-implantação (DGP) vem se destacando na área da biotecnologia da reprodução animal por motivos econômicos. Um exemplo de DGP é a predeterminação do sexo da prole. Neste estudo foi verificada a percentagem de embriões bovinos machos e fêmeas produzidos in vitro após a fertilização de oócitos com sêmen selecionado por centrifugação em gradiente de densidade de Percoll ou por migração ascendente (swim-up). No experimento 1 a seleção espermática foi realizada usando o gradiente descontínuo de Percoll de 90% e 45% (T1) e o swimup (T2). No experimento 2 foi utilizado, além do gradiente descontínuo, um gradiente contínuo de densidade de Percoll de 67,5%, e tempos de centrifugação de 5 e 10 minutos, totalizando 4 tratamentos (TI = contínuo 5 minutos, TII = descontínuo 5 minutos, TIII = contínuo 10 minutos e TIV = descontínuo 10 minutos). A sexagem dos embriões foi realizada através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). No T1 (n=185) foram obtidos 48,65% (n=90) de embriões masculinos e 51,35% (n=95) de femininos e no T2 (n=142) 58,45% (n=83) foram machos e 41,55% (n=59) fêmeas. No experimento 2, a percentagem de embriões masculinos e femininos no TI (n=93), TII (n=70), TIII (n=82) e TIV (n=82) foi de 49,46% (n=46) e 50,54% (n=47), 57,14% (n=40) e 42,86% (n=30), 36,59% (n=30) e 63,41% (n=52), e 48,78% (n=40) e 51,22% (n=42), respectivamente. Não houve alteração na percentagem de machos e fêmeas nos tratamentos dos experimentos 1 e 2 quando estes tratamentos foram comparados individualmente com a percentagem teoricamente esperada de 50% de cada sexo. Também não houve alteração na percentagem de machos e fêmeas na comparação entre os dois tratamentos do experimento 1 e entre os quatro tratamentos do experimento 2.