Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-10-13T16:09:33Z No. of bitstreams: 1 Karen Mascaro Goncalves da Silva.pdf: 349376 bytes, checksum: df0b08aa2b38c52538bbf3e08f2e8413 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-13T16:09:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karen Mascaro Goncalves da Silva.pdf: 349376 bytes, checksum: df0b08aa2b38c52538bbf3e08f2e8413 (MD5) Previous issue date: 2007-02-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / To evaluate the effect of the season in the sperm quality of the equine semen and the use of antioxidant substances in the extender before and after thawed, three experiments was performed. In the Exp. 1, in natura semen of three Mangalarga Marchador stallions, in the breeding season (BS) and not breedii station (NBS), which had been frooze in machine using comrnercial extender FR.5 (Tris-egg yolk with glicerol 5%). After thawed at 37 'C for 30 sec.. the samples had been evaluated to volume (Vo),concentration (Co), total motility (TM) and progressive motility (MP), vigor (v), acrossomal (Aci) and DNA (DNAi) integrity, in BS and NBS, as well as proteins of sperm membrane of in natura semen. The Vo and the Co at NBS were higher than BS.TM and PM in the in natura semen in the BS were higher (P<0.05) than those at NBS. On the thawed semen. there was no difference at BS and NBS. In the same way, the V at in nahrra semen was higher (P<0.05) in the samples collect at BS. After thawing, there was no significant variation and the values were lower than to those at in natura semen. The Aci analysis was similar on in natura semen at two stations. The sperm cells have intact DNA at in natura samples, on both seasons, with values similar on the thawed semen at BS and NBS. It was observed 33 spots on the in natura semen at BS and 46 spots at NBS referring to sperm membrane proteins on the semen pool of each stdlion. The 36 to 97 kDa proteins were present only at BS. It was obsewed that the spots of membrane proteins of the three stallions were concentrated between 4 and 6 iso-electric points. On the Exp. 2, it was analysed the effect of the antioxidants on the fieezing INRA82-HEPES, on stallions of different breeds classified as fertile and subfertile.It was used INRA82-HEPES without antioxidants (TI), supplemented with 120 mM of Trolox (T2) or 2 mM of Phvate (T3). The thawed samples were evaluated according to PM, membrane integrity (Mi), Aci and DNAi, membrane stability (MS) and mitochondrial membrane potential (AY). It was observed that the fertile animals had higher TM and PM in relation to the subfertile animals, independent of the antioxidant addition. To comparing the sperm parameters of the stallions, in accordance with fertiíity and antioxidant substance addition, it was observed that the phvate addition pmvided results higher (P<0.05) than those of Trolox in TM. In the Exp. 3, it was observed the use of antioxidants after semen thawing on the same stallions and freezing technique of Exp. 1. After thawing, it was used the treatments: T1= 150 pL of semen + 150 pL of Tris (Control); T2= 150 pL of semen + 150 pL of Tris + 120 p W m L of Trolox; T3= 150 pL of semen + 150 pL of Tris + 3,5 mM of Pentoxyfiline; T4= 150 pL of semen + 150 pL of Tris + 3,5 mM of Pentoxyfiline + 120 pM/rnL of Tmlox, and the samples were analyzed at 0, 60 and 120 minutes of incubation (37 "C) according to TM, PM, Aci and DNAi. Significant dserences (P~0.05)w as seen due tothe incubation time period on TM and PM at 120 min., however no difference was seen in the treatment x time incubation interaction. Based on the results we hypothethized that proteins with molecular weights between 97 and 36 kDa can be possible fertility L pointers of sperm quality; the phvate addition improve TM of fertile and sub-fertile I stallions and the Trolox addition at extender after thawing of the equine semèn preserve I the TM and PM of the sperm cells submitted to incubation (37 'C) during 120 minutes. / Para avaliar o efeito da esta60 do ano na qualidade espermática do sêmen eqüino e uso de antioxidantes na diluiqão antes e depois da congelaqão, foram realizados três experimentos. No Exp. 1, colheu-se amostras de sêmen de três garanhóes da raça Mangalarga Marchador, na estação reprodutiva (ER) e estação não reprodutiva (ENR), as quais foram congeladas em máquina de congelação utilizando o diluidor comercial FR5 (Tris-gema com glicerol a 5%). Após descongelação a 37 "C por 30 segundos, as amostras foram avaliadas quanto a volume (Vo), concentração (Co), motilidades total (MT) e progressiva (MP), vigor (V), acrossoma (Aci) e DNA @NA) integ;os, na ER e ENR, assim como proteínas de membrana espermática do sêmen in natura. O VO e a CO na ENR foram maiores do que na ER. A MT e MP no sêmen in natura colhidos na ER foram superiores (P<0,05) aqueles da ENR. No sêmen descongelado, não se constatou diferença significativa entre as estações do ano. Da mesma forma, o V do sêmen in natura foi superior (P<0,05) nas amostras colhidas na ER. Após a descongelação, não houve variação significativa e os valores foram inferiores aqueles evidenciados in natura. Não houve diferença significativa para Aci, apresentando porcentual médio no sêmen descongelado semelhante ao in natura, nas duas estações, assim como na avaliação do DNA. Foram encontrados 33 e 46 pontos protéicos no sêmen in nattrra na ER e ENR, respectivamente, referentes as proteinas de membrana espermática do pool de sêmen de cada garanhão. A maioria das proteínas de 97 a 36 kDa estiveram presentes apenas na ENR. Observou-se também que os pontos protéicos de membrana dos três garanhões concentraram-se entre os pontos isoelétricos 4 e 6. No Exp. 2, analisou-se o efeito da aqão de antioxidantes ao diluidor de congelaqão INRA82-HEPES, sendo utilizados animais de raças distintas classificados como férteis e subférteis. Utilizou-se INRA82-HEPES sem antioxidantes (TI), acrescido de 120 mM de Trolox (T2) ou 2mM de Pimvato (T3). As amostras descongeladas foram avaliadas quanto a MP, integridade de membrana (Mi), Ai e DNAi, estabilidade membranar (EM) e potencial de membrana mitocondrial (AY) logo após a descongelação. Observou-se que os animais férteis apresentaram superioridade nas MT e MP em relação aos animais sub-férteis, independente da adição de antioxidante. Ao se comparar os parâmetros espedticos dos garanhões, de acordo com a fertilidade e a adiqão de substâncias antioxidantes, constatou-se que a adição do Piruvato proporcionou resultados superiores (P<0,05) aqueles obtidos com Trolox na MT. No Exp. 3, avaliou-se o uso de antioxidantes após a congelação do sêmen dos mesmos garanhões do Exp. 1, usando a mesma técnica de congelação. Após descongelação, utilizaram-se os tratamentos: T1= 150 pL de sêmen + 150 pL de Tris (Controle); T2= 150 pL de sêmen + 150 pL de Tris + 120 pIWmL de Trolox; T3= 150 pL de sêmen + 150 pL de Tris + 3,5 mM de Pentoxifilina e T4= 150 pL de sêmen + 150 pL de Tris + 3,5 mM de Pentoxifilina + de 120 pMImL Trolox, e asamostras foram analisadas aos 0,60 e 120 minutos de incubação (37 'C) quanto a MT, MP, Aci e DNAi. Em função do tempo de incubação das amostras verificaram-se diferenças (P<0,05) na MT e MP aos 120 minutos, porém na interação tratamento x tempo não foi constatada qualquer significância. Por conseguinte, julga-se que as proteínas entre 97 e 36 kDa podem ser possíveis indicadores de qualidade espermática; a adição de Piruvato melhora a motilidade total em garanhões férteis e subférteis; e a adição de Trolox ao diluente utilizado após a descongelaflo do sêmen equino preserva a MT e MP das células espermáticas submetidas a incubação a 37 'C durante 120 minutos.

Sperm function has been studied in multiple research fields as it is essential to male fertility. In previous studies a variety of sperm traits have been examined as an assessment of sperm function. Among those traits, sperm viability, sperm motility and sperm metabolism are often commonly examined. However, sperm function can be influenced by both environmental and genetic factors. Specifically, nuclear genome has been demonstrated to play a role in sperm function, especially in sperm competitive capacity. There are increasing evidence for effects of mitochondrial genome on sperm function. Mitochondrial genetic variance has been suggested to affect sperm length and sperm viability in seed beetle and sperm metabolism in rodent. Given the coordinated collaborations between nuclear and mitochondrial genomes in OXPHOS, replication and transcription of mitochondrial genome as well as intergenomic signalling, potential mitonuclear effects on sperm function are expected even though empirical evidence so far remains less. A recent review summarised all the previous work on environmental effects on sperm and found that various factors affects sperm function but largely neglected in ecology and evolution. In the study, we used D. melanogaster as a model to disentangle both genetic and environmental components of sperm function at sperm cell, ejaculate and offspring levels. We found environmental effects on sperm function in D. melanogaster. Specifically, sperm incubation buffers affect sperm viability in chapter 2 and dietary PUFAs influence sperm volume and metabolism in chapter 4. Nuclear effects were found on sperm viability, sperm quality and male fertility in chapter 3. Mitochondrial genome was found to have an effect on sperm function, i.e. sperm viability and sperm quality differed among mitochondrial haplotypes examined. In addition, sperm function was further modified by the interaction of nuclear and mitochondrial genomes in ageing male. Sperm quality and fertilization success were suggested to be dependent on age-related mitonuclear interaction in chapter 3. Moreover, we examined the mitonuclear coadaptation hypothesis in the function of D. melanogaster sperm. No evidence for mitonuclear coadaptation hypothesis was found for sperm function in D. melanogaster as there were no difference between coadapted and non-coadapted lines in sperm traits examined. Lastly, we found that sperm viability, sperm quality and sperm metabolic rate cannot predict male fertility in D. melanogaster as correlation analysis revealed no relationship between them. Our experiment explored and disentangled the genetic and environmental components of sperm function at multiple levels in D.melanogaster systematically. Our results suggested that both mitochondrial and nuclear genome as well as the interaction between them play a role in sperm function in D. melanogaster. In addition to genetic components, our findings revealed environmental components of Drosophila sperm and suggested that it was phenotypic plastic.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-22Bitstream added on 2014-06-13T20:19:17Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_lz_me_jabo.pdf: 560786 bytes, checksum: c8f1ff167a93ccb809fee9a007e2147b (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Algumas avaliações da capacidade de fecundação como a produção in vitro de embriões (PIV) e a coloração vital indicam que a sexagem de espermatozóides por centrifugação em gradiente de densidade pode causar diminuição nas taxas de desenvolvimento embrionário, entretanto, não são conclusivas quanto à avaliação da integridade das membranas espermáticas. Com o intuito de obter dados mais precisos em relação à viabilidade espermática pós-sexagem, foram descongeladas doses de sêmen de 6 touros diferentes, e avaliadas quanto aos danos espermáticos causados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll (com densidade variando de 1,111g/mL a 1,123g/mL). Antes e após a centrifugação dos espermatozóides, além das avaliações de concentração, motilidade e morfologia, o sêmen foi ainda avaliado quanto à integridade das membranas plasmáticas, acrossomal e mitocondrial pela associação das sondas fluorescentes: Iodeto de Propídio (PI), aglutinina de Pisum Sativum conjugado a Isotiocianato de flurosceína (FITC-PSA) e Iodeto de 5,5’,6,6’-tetracloro- 1,1,3,3’-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1). Os resultados demonstraram que o processo de separação de espermatozóides X e Y por centrifugação em gradiente de densidade promoveu uma melhora nas características associadas à motilidade progressiva, além de uma significativa diminuição na incidência de defeitos maiores. Ainda nas amostras pós-centrifugação, foi observado um aumento no percentual de células com Membrana Plasmática Intacta e com Alto Potencial Mitocondrial. No entanto, o percentual de células com Membrana Acrossomal Intacta foi sensivelmente diminuída provavelmente devido ao fenômeno de reação acrossomal desencadeado pela centrifugação. / Some fecundity evaluations as the in vitro embryo production (IVP) and the vital stains have indicating that the density gradients centrifugation techniques can reduce the embryo development rates. However they are not conclusive for the integrity of spermatic membranes. Wit the purpose of obtain more precise sperm viability data after the sexing procedure, frozen semen samples from six different bulls were thawed and assessed for spermatic damage caused by centrifugation in discontinuous Percoll gradient (with density varying from 1,111g/mL to 1,123g/mL). Before and after the separation of X-bearing bovine sperm, were evaluated the sperm concentration, motility and morphology. Moreover the semen samples were assessed for integrity of plasma, acrosome and mitochondrial membranes by fluorescent probes association: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate–Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and 5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1’,3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). The results demonstrated that the X-bearing sperm separation process by density gradient centrifugation caused an increase in the progressive motility parameters and a decrease in the major defects incidence. In addition, it was observed an increase in the cells categories with Intact Plasma Membrane and High Mitochondrial Membrane potential in the post-centrifugation samples. Nevertheless, the percentage of cells with Intact Acrossome Membrane was reduced probably due to the acrosome reaction phenomenon induced by centrifugation.

A motilidade espermática depende do consumo de energia. Em algumas espécies, a mitocôndria espermática tem um importante papel na produção de energia para o batimento flagelar. A irradiação com Laser de baixa intensidade aumenta a produção de energia funcionando como uma ferramenta de biomodulação. O objetivo deste estudo foi analisar o efeito da irradiação contínua de 650 nm de comprimento de onda de Laser Diodo, com dose de 6 J/cm2 por 120s, na motilidade, integridade das membranas plasmática e acrossomal e no potencial de membrana mitocondrial em espermatozóides in natura e criopreservados. Cinco ejaculados foram obtidos de cinco garanhões (n=25). O sêmen foi acondicionado em palhetas de 0,5mL com 200x106 cells/mL em diluidor Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brasil) e congelado utilizando o sistema automático programável (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação_Ltda, Uberaba, Brasil). As amostras in natura foram divididas em dois grupos: espermatozóides tratados COM LASER e espermatozóides não tratados - SEM LASER. As amostras congeladas foram divididas em três grupos: espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação; espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação e espermatozóides criopreservados não tratados SEM LASER. As amostras criopreservadas foram analisadas imediatamente após a descongelação (tempo zero) e duas horas após a descongelação (tempo 2). A motilidade foi avaliada pelo sistema de análise espermática computadorizada (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), a integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial foram avaliados pela técnica de citometria de fluxo (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). Os dados foram analisados pelo programa SAS, com nível de significância de 5%. A freqüência de batimentos flagelar (BCF) foi alta (P<0,05) para o grupo de espermatozóides in natura tratados COM LASER (34,8 ± 0,7%) quando comparado com o grupo de espermatozóides in natura não tratados SEM LASER (33,4 ± 0,8%). No tempo zero, o potencial de membrana mitocondrial foi baixo no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (40,7 ± 1,5%) quando comparados com o grupo de espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER (47,4 ± 2,4%) (P<0,05). Duas horas após a descongelação, as membranas plasmática e acrossomal apresentavam maior porcentagem de integridade no grupo de espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação (8,3 ± 0,7%) do que no grupo congelado não tratados - SEM LASER (6,2 ± 0,6%) (P<0,05). O grupo de espermatozóides tratados COM LASER depois da congelação não diferiu (P>0,05) dos outros grupos do tempo 2, porém no tempo zero a porcentagem de espermatozóides com motilidade progressiva foi baixa (2,0 ± 0,3%) e diferente (P<0,05) dos outros grupos (6,5 ± 1,3 nos espermatozóides tratados COM LASER antes da congelação e 5,5 ± 1,1% nos espermatozóides congelados não tratados - SEM LASER). Estes resultados indicam que a irradiação de 650 nm de comprimento de onda aumenta a freqüência de batimentos flagelar no sêmen fresco e confere melhor proteção à membrana plasmática e acrossomal ao longo do tempo (após 2h de incubação). Os resultados com sêmen congelado permitem concluir que o melhor momento para a aplicação do laser é antes da criopreservação. Novos estudos com diferentes comprimentos de onda, potência do raio e dosagem devem ser conduzidos para se obter um melhor protocolo visando aprimorar a criopreservação do sêmen eqüino. / Sperm motility depends on energy consumption. In some species sperm mitochondria play an important role in the production of energy for tail activity. Low-level laser irradiation increases this production as a modulation tool. The objective of this study was to analyze the effect of a continuous 650 nm wavelength diode laser irradiation, with dose 6 J/cm2 for 120s, in the motility, plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential in fresh and frozen equine spermatozoa. Five ejaculates were obtained from five stallions (n=25). Semen was packaged into 0.5mL straws with 200x106 cells/mL in a Botu-CrioTM (Biotech-Botucatu-Ltda/ME, Botucatu, Brazil) and frozen by automated technique using a programmed machine (TK3000®, TK Tecnologia em Congelação-Ltda, Uberaba, Brazil). Fresh samples were divided in two groups: spermatozoa treated with laser and without laser (non treated spermatozoa), and frozen samples in three groups: spermatozoa treated with laser before freezing; spermatozoa treated with laser after thawing and without laser (cryopreserved spermatozoa). Cryopreserved samples were analyzed immediately after thawing (time 0) and two hours after thawing (time 2). Motility was evaluated by computer assisted sperm analysis (CASA, Ivos-Ultimate of Hamilton Thorne Biosciences), plasma and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential were evaluated by flow cytometry (FACSaria-Beckton-Dickeson, San Jose, USA). The data were analyzed by the SAS program, at a 5% level. Beat cross frequency (BCF) test was higher (p<0.05) for fresh semen group treated with laser (34.8 ± 0.7%) as compared to non treated group (without Laser - 33.4 ± 0.8%). At time zero, mitochondrial membrane potential was lower in laser treatment before freezing group (40.7 ± 1.5%); compared to without laser treatment group (cryopreserved spermatozoa - 47.4 ± 2.4%) (P<0.05). Two hours after thawing, plasma and acrosomal integrity was higher (P<0.05) in the group were spermatozoa were treated with laser before freezing (8.3 ± 0.7%) compared with the group without laser treatment (cryopreserved spermatozoa) (6.2 ± 0.6%). The group treated with laser after thawing didn´t show any difference (P>0.05) compared to the others groups at this period. However, at time 0 percentage of progressive motility was lower (2.0 ± 0.3%) (P<0.05) than groups treated with laser before freezing (6.5 ± 1.3%) and cryopreserved without laser (5.5 ± 1.1%). These results indicated that the irradiation of 650 nm wavelength diode laser improves beat cross frequency in the fresh semen and support a long term (2 hours) protection to plasma and acrosomal membrane of equine spermatozoa. Based on the results of frozen semen, the best moment for laser application is before cryopreservation protocol. New studies with different diode laser wavelength, different power and energy doses should be driven in order to improve stallion semen cryopreservation.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_elisangela_madeira.pdf: 269361 bytes, checksum: 0f80449efc17473198ff8837f06f02f4 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The objectives of this study were to determine the main bacteria present in ram semen and to evaluate the efficiency of distinct antibiotics in controlling such microorganisms and on sperm viability. Ejaculates were collected from five rams and extended in TRIS-egg yolk. In Experiment 1, the following treatments were tested: control, with no antibiotics; GTLS, with 500 μg/ml of gentamicin, 100 μg/ml of tylosin, 300 μg/ml of lincomycin and 600 μg/ml of spectinomycin; PENSTREP, with 500 μg/ml of penicillin and 100 μg/ml of streptomycin; CEFT, with 50 μg/ml of sodium ceftiofur; and ENRO, with 1000 μg/ml of enrofloxacin. For bacteria identification, samples were collected: the preputial ostium; the artificial vagina; the ejaculates; the semen pool from the five rams; after treatments allocation and stabilization at 5°C; and after thawing. In Experiment 2, variation in the antibiotics concentrations used in Experiment 1 were tested: 25% higher (GTLS+25, PENSTREP+25, CEFT+25 and ENRO+25); 50% higher (GTLS+50, PENSTREP+50, CEFT+50 and ENRO+50); 25% lower (GTLS-25, PENSTREP-25, CEFT-25 and ENRO-25); and 50% lower (GTLS-50, PENSTREP-50, CEFT-50 and ENRO-50). Samples of ram semen were used for counting colony forming units (CFU). The isolated microorganisms were Staphylococcus sp., Klebsiella sp., Corynebacterium sp. and Bacillus sp. The ENRO treatment presented the lowest sperm motility for semen cooled at 5°C and after thawing (P < 0.05), although the post-thawing motility did not differ from that observed for the CEFT and GTLS treatments (P > 0.05). No differences were observed among treatments regarding sperm membrane, acrosome and sperm DNA integrity (P > 0.05). The post-thawing proportion of sperm having DNA integrity was greater for the PENSTREP than for the GTLS treatment (P < 0.05), although sperm DNA integrity may have been impaired by the freezing-thawing process. In experiment 2, the GTLS+50, PENSTREP, ENRO+25 and ENRO+50 treatments presented reduced sperm motility (P < 0.05). All treatments reduced the number of CFU in comparison with the control treatment (P < 0.05). The CFU for the GTLS+50, ENRO+25 and ENRO+50 treatments and the concentrations tested for both those treatments did not differ (P < 0.05), although both were more effective than the PENSTREP and CEFT treatments (P < 0.05). However, the ENRO treatment was associated with reduced sperm motility, especially with high antibiotic concentrations. The treatments did not influence sperm morphology and the integrity of sperm membrane, acrosome and DNA. / Este estudo tem como objetivos determinar os principais gêneros bacterianos presentes no sêmen ovino e avaliar a ação de diferentes antibióticos no controle destes microrganismos e o seu impacto sobre a viabilidade espermática. Todos os ejaculados foram coletados de cinco machos ovinos e diluídos em Tris-gema de ovo. No experimento 1 foram testados os seguintes tratamentos: Controle sem antibiótico; GTLS, com 500 μg/ml de gentamicina, 100 μg/ml de tilosina, 300 μg/ml de lincomicina e 600 μg/ml de espectinomicina; PENSTREP, com 500 μg/ml de penicilina e 100 μg/ml de estreptomicina; CEFT, com 50 μg/ml de ceftiofur sódico; e ENRO, com 1000 μg/ml de enrofloxacina. Para a identificação dos gêneros bacterianos presentes, amostras foram colhidas do óstio prepucial, da vagina artificial, dos ejaculados carneiros, do pool de sêmen dos cinco carneiros e após a inclusão dos tratamentos e estabilização a 5 °C e após o descongelamento. No experimento 2, foram testadas variações nas concentrações de antibióticos avaliadas no Experimento 1: 25% acima (GTLS+25; PENSTREP+25; CEFT+25; ENRO+25), 50% acima (GTLS+50; PENSTREP+50; CEFT+50; ENRO+50), 25% abaixo (GTLS-25; PENSTREP-25; CEFT-25; ENRO-25) e 50% abaixo (GTLS-50; PENSTREP-50; CEFT-50; ENRO-50). Amostras de sêmen dos carneiros foram utilizadas para contagem das unidades formadoras de colônias (UFC). Os microrganismos isolados foram Staphylococcus sp., Klebsiella sp., Corynebacterium sp. e Bacillus sp. O tratamento com enrofloxacina apresentou a motilidade espermática mais baixa para o sêmen refrigerado a 5 °C e após o descongelamento (P<0,05), no entanto a motilidade pósdescongelamento não diferiu (P>0,05) dos tratamentos CEFT e GTLS. Não foram observadas diferenças entre os tratamentos quanto à integridade da membrana plasmática, do acrossoma e do DNA espermático (P>0,05). Após o descongelamento, o percentual de espermatozóides com DNA íntegro foi maior (P<0,05) no tratamento PENSTREP em relação ao GTLS, apesar de que este parâmetro pode ter sido afetado pelo processo de criopreservação. No experimento 2, GTLS+50, PENSTREP, ENRO+25 e ENRO+50 foram os tratamentos que apresentaram redução na motilidade espermática (P<0,05). Todos os tratamentos reduziram consideravelmente o número de UFC em relação ao grupo controle. A contagem de UFC para os tratamentos GTLS+50, ENRO+25 e ENRO+50 e as variações de concentração para ambos não foram diferentes entre si (P>0,05), porém ambos foram mais efetivos que os tratamentos PENSTREP e CEFT (P<0,05). Porém, o tratamento com enrofloxacina prejudicou a motilidade espermática, especialmente quando se elevou a concentração Os tratamentos não influenciaram a morfologia, integridade da membrana plasmática, integridade de acrossoma e integridade de DNA dos espermatozóides.

A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.

A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.

Resumo: Algumas avaliações da capacidade de fecundação como a produção in vitro de embriões (PIV) e a coloração vital indicam que a sexagem de espermatozóides por centrifugação em gradiente de densidade pode causar diminuição nas taxas de desenvolvimento embrionário, entretanto, não são conclusivas quanto à avaliação da integridade das membranas espermáticas. Com o intuito de obter dados mais precisos em relação à viabilidade espermática pós-sexagem, foram descongeladas doses de sêmen de 6 touros diferentes, e avaliadas quanto aos danos espermáticos causados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll (com densidade variando de 1,111g/mL a 1,123g/mL). Antes e após a centrifugação dos espermatozóides, além das avaliações de concentração, motilidade e morfologia, o sêmen foi ainda avaliado quanto à integridade das membranas plasmáticas, acrossomal e mitocondrial pela associação das sondas fluorescentes: Iodeto de Propídio (PI), aglutinina de Pisum Sativum conjugado a Isotiocianato de flurosceína (FITC-PSA) e Iodeto de 5,5',6,6'-tetracloro- 1,1,3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1). Os resultados demonstraram que o processo de separação de espermatozóides X e Y por centrifugação em gradiente de densidade promoveu uma melhora nas características associadas à motilidade progressiva, além de uma significativa diminuição na incidência de defeitos maiores. Ainda nas amostras pós-centrifugação, foi observado um aumento no percentual de células com Membrana Plasmática Intacta e com Alto Potencial Mitocondrial. No entanto, o percentual de células com Membrana Acrossomal Intacta foi sensivelmente diminuída provavelmente devido ao fenômeno de reação acrossomal desencadeado pela centrifugação. / Abstract: Some fecundity evaluations as the in vitro embryo production (IVP) and the vital stains have indicating that the density gradients centrifugation techniques can reduce the embryo development rates. However they are not conclusive for the integrity of spermatic membranes. Wit the purpose of obtain more precise sperm viability data after the sexing procedure, frozen semen samples from six different bulls were thawed and assessed for spermatic damage caused by centrifugation in discontinuous Percoll gradient (with density varying from 1,111g/mL to 1,123g/mL). Before and after the separation of X-bearing bovine sperm, were evaluated the sperm concentration, motility and morphology. Moreover the semen samples were assessed for integrity of plasma, acrosome and mitochondrial membranes by fluorescent probes association: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate-Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). The results demonstrated that the X-bearing sperm separation process by density gradient centrifugation caused an increase in the progressive motility parameters and a decrease in the major defects incidence. In addition, it was observed an increase in the cells categories with Intact Plasma Membrane and High Mitochondrial Membrane potential in the post-centrifugation samples. Nevertheless, the percentage of cells with Intact Acrossome Membrane was reduced probably due to the acrosome reaction phenomenon induced by centrifugation. / Orientadora: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Rubens Paes de Arruda / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Eneiva Carla Carvalho Celeghini / Mestre

A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.