A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.

A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.

A água empregada na produção de doses inseminantes (DIs) de suínos pode ser um dos veículos de introdução de bactérias contaminantes, podendo levar à perda de qualidade das mesmas. O objetivo do presente estudo foi avaliar o número de mesófilos aeróbios totais (MAT) na água utilizada em centrais de inseminação de suínos e sua influência nas contagens bacterianas das DIs produzidas. Foram conduzidos três ciclos de amostragem em seis centrais de inseminação (A-F), intencionalmente incluídas no estudo de acordo com os critérios: estar localizada no sul do Brasil; produzir >1.000 DIs mensais; e concordar em participar do estudo. A cada ciclo, eram colhidas amostras de água antes da purificação, água após a passagem pelo sistema de purificação, água após armazenamento, diluente, sêmen in natura de três machos distintos de fertilidade comprovada; e das respectivas doses inseminantes preparadas com sêmen e diluente amostrados. A água colhida antes do sistema de purificação foi avaliada quanto ao número mais provável (NMP) de coliformes totais e Escherichia coli, em 100 mL. pela técnica dos tubos múltiplos. Todas as amostras colhidas foram avaliadas quanto ao número de mesófilos aeróbios totais (MAT), por meio da semeadura em profundidade em Ágar para Contagem (PCA). Todas as 18 amostras de água colhidas antes da purificação apresentaram <1,1 NMP.100 mL-1 de Escherichia coli. A média de MAT nas amostras de água variou entre 0,1 log UFC.mL-1 na água após-purificação da central E e 3,5 log.UFC.mL-1 na água antes da purificação da central F. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre as contagens médias de MAT obtidas em diferentes tipos de amostra de água e entre as centrais de inseminação. A média de MAT nas amostras de diluente variou de 0,16 log UFC. mL-1 à 2,78 log UFC.mL-1. As centrais D e F apresentaram diluentes significativamente (P<0,05) mais contaminados. No sêmen, a média de MAT variou de 1,75 log. UFC.mL-1 à 3,79 log UFC.mL-1 e nas DIs entre 0,73 log.UFC.mL-1 e 2,88 log UFC.mL-1. A central de inseminação F apresentou média de MAT significativamente (P<0,05) maior que as demais centrais. Considerando os padrões existentes, conclui-se que a água captada, purificada e armazenada apresentou boa qualidade microbiológica em todas as centrais de inseminação e não influenciou a média de mesófilos aeróbios totais das DIs preparadas. O incremento de bactérias, quando observado, foi provavelmente resultante da contaminação de origem ambiental durante o preparo do diluente e das doses inseminantes. / The water employed in the production of insemination doses (IDs) of swine may be one of the vehicles for introduction of contaminant bacteria, and can lead to their quality loss. The objective of this study was to assess the number of total aerobic mesophilic (TAM) in water used in swine artificial insemination centers (SAIC) and its influence in the total bacterial counting of the IDs produced. Three cycles of sampling were conducted in six SAIC (A-F) intentionally included in the study according to the following criteria: to be located in the south of Brazil, to produce > 1.000 (IDs) monthly, and to agree in participating of the study. At each cycle, samples were collected from water before the purification, water after passage through the purification system, water after storage, extenders, fresh semen collected from three different boars and the respective (ID) prepared with the semen and extender sampled. The water collected before the purification system was evaluated for total coliforms and Escherichia coli most probable number (NMP) in 100 mL using the multiple tubes technic. All samples collected were evaluated for the number of total aerobic mesophilic (TAM) by the pour plate technic. All the 18 samples of water collected before the purification presented < 1.1 NMP. 100 mL-1 of Escherichia coli. The average of TAM in the water samples varied between 0.1 log.CFU. ml-1 in the water after purification of the central E and 3.5 log. CFU.mL-1 in the water before purification of the central F. There was no significant difference (P>0.05) among the average counting of TAM obtained in different water samples types and among SAICs. The average TAM in samples of diluents varied from 0.16 log.CFU.mL-1 to 2.78 log.CFU.mL-1; the SAICs D and F presented diluents significantly (P< 0.05) more contaminated. Among the semen samples, the TAM average varied from 1.75 log.CFU.mL-1 to 3.79 log CFU.mL-1 and in the DIs between 0.73 log.CFU.mL-1 and 2.88 log.CFU.mL-1. The SAIC F presented average of TAM significantly (P<0.05) higher than the others SAICs. Considering the available standards, it was concluded that water collected, purified and stored presented a good microbiological quality in all insemination centers and did not influence the number of TAM in the prepared IDs. The increase on bacterial population may have resulted from contamination of environmental origin during the preparation of the extender and insemination doses.

A água empregada na produção de doses inseminantes (DIs) de suínos pode ser um dos veículos de introdução de bactérias contaminantes, podendo levar à perda de qualidade das mesmas. O objetivo do presente estudo foi avaliar o número de mesófilos aeróbios totais (MAT) na água utilizada em centrais de inseminação de suínos e sua influência nas contagens bacterianas das DIs produzidas. Foram conduzidos três ciclos de amostragem em seis centrais de inseminação (A-F), intencionalmente incluídas no estudo de acordo com os critérios: estar localizada no sul do Brasil; produzir >1.000 DIs mensais; e concordar em participar do estudo. A cada ciclo, eram colhidas amostras de água antes da purificação, água após a passagem pelo sistema de purificação, água após armazenamento, diluente, sêmen in natura de três machos distintos de fertilidade comprovada; e das respectivas doses inseminantes preparadas com sêmen e diluente amostrados. A água colhida antes do sistema de purificação foi avaliada quanto ao número mais provável (NMP) de coliformes totais e Escherichia coli, em 100 mL. pela técnica dos tubos múltiplos. Todas as amostras colhidas foram avaliadas quanto ao número de mesófilos aeróbios totais (MAT), por meio da semeadura em profundidade em Ágar para Contagem (PCA). Todas as 18 amostras de água colhidas antes da purificação apresentaram <1,1 NMP.100 mL-1 de Escherichia coli. A média de MAT nas amostras de água variou entre 0,1 log UFC.mL-1 na água após-purificação da central E e 3,5 log.UFC.mL-1 na água antes da purificação da central F. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre as contagens médias de MAT obtidas em diferentes tipos de amostra de água e entre as centrais de inseminação. A média de MAT nas amostras de diluente variou de 0,16 log UFC. mL-1 à 2,78 log UFC.mL-1. As centrais D e F apresentaram diluentes significativamente (P<0,05) mais contaminados. No sêmen, a média de MAT variou de 1,75 log. UFC.mL-1 à 3,79 log UFC.mL-1 e nas DIs entre 0,73 log.UFC.mL-1 e 2,88 log UFC.mL-1. A central de inseminação F apresentou média de MAT significativamente (P<0,05) maior que as demais centrais. Considerando os padrões existentes, conclui-se que a água captada, purificada e armazenada apresentou boa qualidade microbiológica em todas as centrais de inseminação e não influenciou a média de mesófilos aeróbios totais das DIs preparadas. O incremento de bactérias, quando observado, foi provavelmente resultante da contaminação de origem ambiental durante o preparo do diluente e das doses inseminantes. / The water employed in the production of insemination doses (IDs) of swine may be one of the vehicles for introduction of contaminant bacteria, and can lead to their quality loss. The objective of this study was to assess the number of total aerobic mesophilic (TAM) in water used in swine artificial insemination centers (SAIC) and its influence in the total bacterial counting of the IDs produced. Three cycles of sampling were conducted in six SAIC (A-F) intentionally included in the study according to the following criteria: to be located in the south of Brazil, to produce > 1.000 (IDs) monthly, and to agree in participating of the study. At each cycle, samples were collected from water before the purification, water after passage through the purification system, water after storage, extenders, fresh semen collected from three different boars and the respective (ID) prepared with the semen and extender sampled. The water collected before the purification system was evaluated for total coliforms and Escherichia coli most probable number (NMP) in 100 mL using the multiple tubes technic. All samples collected were evaluated for the number of total aerobic mesophilic (TAM) by the pour plate technic. All the 18 samples of water collected before the purification presented < 1.1 NMP. 100 mL-1 of Escherichia coli. The average of TAM in the water samples varied between 0.1 log.CFU. ml-1 in the water after purification of the central E and 3.5 log. CFU.mL-1 in the water before purification of the central F. There was no significant difference (P>0.05) among the average counting of TAM obtained in different water samples types and among SAICs. The average TAM in samples of diluents varied from 0.16 log.CFU.mL-1 to 2.78 log.CFU.mL-1; the SAICs D and F presented diluents significantly (P< 0.05) more contaminated. Among the semen samples, the TAM average varied from 1.75 log.CFU.mL-1 to 3.79 log CFU.mL-1 and in the DIs between 0.73 log.CFU.mL-1 and 2.88 log.CFU.mL-1. The SAIC F presented average of TAM significantly (P<0.05) higher than the others SAICs. Considering the available standards, it was concluded that water collected, purified and stored presented a good microbiological quality in all insemination centers and did not influence the number of TAM in the prepared IDs. The increase on bacterial population may have resulted from contamination of environmental origin during the preparation of the extender and insemination doses.

A homogeneização das doses de sêmen suíno e a ressuspensão dos espermatozoides durante o armazenamento têm sido considerados como procedimentos benéficos para a qualidade espermática. Contudo, os fundamentos acerca dessa recomendação não estão completamente elucidados. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da homogeneização nos parâmetros espermáticos e status oxidativo das doses de sêmen suíno durante o armazenamento. Vinte e um ejaculados suínos normospérmicos foram diluídos em split sample nos diluentes Androstar® Plus (AND) e Beltsville Thawing Solution (BTS) e as doses de sêmen foram submetidas aos protocolos sem homogeneização (NoHom) ou com homogeneização manual duas vezes ao dia (2xHom) durante o armazenamento a 17ºC por 168 h. Os parâmetros espermáticos foram avaliados de acordo com motilidade espermática, cinética espermática e integridade de membrana com as sondas fluorescentes SYBR-14/PI através do sistema CASA, integridade de acrossoma sob microscopia óptica com contraste de fase, teste de termorresistência a 38ºC por 30 min e 120 min, e pH das doses de sêmen. O status oxidativo foi determinado pela peroxidação lipídica, oxidação proteica, teor de grupos sulfidrila, espécies reativas intracelulares, potencial antioxidante total e atividade enzimática da superóxido dismutase (SOD). As doses inseminantes submetidas a NoHom ou 2xHom foram semelhantes (P>0,05) na maioria dos parâmetros espermáticos e oxidativos avaliados, para ambos os diluentes. A NoHom foi superior (P<0,05) à 2xHom quanto à motilidade e cinética espermáticas após o teste de termorresistência por 30 min, à manutenção do pH e à preservação da atividade da SOD. Além disso, melhores resultados nos parâmetros espermáticos e status oxidativo foram evidenciados no diluente AND em comparação ao BTS, exceto na motilidade total e progressiva, que diferiu apenas no final do período de armazenamento, e para espécies reativas intracelulares. Considerando que a homogeneização manual duas vezes ao dia não aprimorou a qualidade espermática e o status oxidativo, este procedimento não é necessário para o armazenamento de doses de sêmen normospérmicas por 168 h, tanto para o diluente Androstar® Plus quanto para o BTS. / Homogenization of diluted boar semen and resuspension of spermatozoa during storage have always been regarded as beneficial for semen quality. Nevertheless, the fundamental basis for its recommendation remains unclear. The aim of this study was to verify the effect of homogenization on spermatic parameters and oxidative status of boar semen doses during storage. One normospermic ejaculate from each of 21 boars was diluted in a split sample design with Androstar® Plus (AND) and Beltsville Thawing Solution (BTS) and semen doses were submitted to no-homogenization (NoHom) or twice-a-day manual homogenization (2xHom) during storage at 17°C for 168 h. Spermatic parameters were assessed upon motility, kinematics and membrane integrity with SYBR-14/PI with CASA system, acrosome integrity under phase-contrast microscopy, thermoresistance test at 38ºC for 30 min and 120 min, and pH. Oxidative status was determined by lipid peroxidation, protein oxidation, sulfhydryl content, intracellular reactive species, total radical-trapping antioxidant potential, and superoxide dismutase (SOD) activity. NoHom and 2xHom of liquid-stored semen doses were similar (P>0.05) in most of the spermatic and oxidative parameters for both AND and BTS extenders. NoHom was superior (P<0.05) to 2xHom regarding sperm motility and kinematics after thermoresistance test for 30 min, pH maintenance, and SOD activity preservation. Additionally, better results were evident for spermatic parameters and oxidative status in AND compared to BTS, except for total and progressive motility, which differed only at the end of the storage period, and intracellular reactive species. Taking into account that no beneficial effects for sperm motility traits and oxidative status were observed following twice-a-day homogenization, its use is not necessary for storage of semen doses for 168 h in both short- and long-term tested extenders.

A água empregada na produção de doses inseminantes (DIs) de suínos pode ser um dos veículos de introdução de bactérias contaminantes, podendo levar à perda de qualidade das mesmas. O objetivo do presente estudo foi avaliar o número de mesófilos aeróbios totais (MAT) na água utilizada em centrais de inseminação de suínos e sua influência nas contagens bacterianas das DIs produzidas. Foram conduzidos três ciclos de amostragem em seis centrais de inseminação (A-F), intencionalmente incluídas no estudo de acordo com os critérios: estar localizada no sul do Brasil; produzir >1.000 DIs mensais; e concordar em participar do estudo. A cada ciclo, eram colhidas amostras de água antes da purificação, água após a passagem pelo sistema de purificação, água após armazenamento, diluente, sêmen in natura de três machos distintos de fertilidade comprovada; e das respectivas doses inseminantes preparadas com sêmen e diluente amostrados. A água colhida antes do sistema de purificação foi avaliada quanto ao número mais provável (NMP) de coliformes totais e Escherichia coli, em 100 mL. pela técnica dos tubos múltiplos. Todas as amostras colhidas foram avaliadas quanto ao número de mesófilos aeróbios totais (MAT), por meio da semeadura em profundidade em Ágar para Contagem (PCA). Todas as 18 amostras de água colhidas antes da purificação apresentaram <1,1 NMP.100 mL-1 de Escherichia coli. A média de MAT nas amostras de água variou entre 0,1 log UFC.mL-1 na água após-purificação da central E e 3,5 log.UFC.mL-1 na água antes da purificação da central F. Não houve diferença significativa (P>0,05) entre as contagens médias de MAT obtidas em diferentes tipos de amostra de água e entre as centrais de inseminação. A média de MAT nas amostras de diluente variou de 0,16 log UFC. mL-1 à 2,78 log UFC.mL-1. As centrais D e F apresentaram diluentes significativamente (P<0,05) mais contaminados. No sêmen, a média de MAT variou de 1,75 log. UFC.mL-1 à 3,79 log UFC.mL-1 e nas DIs entre 0,73 log.UFC.mL-1 e 2,88 log UFC.mL-1. A central de inseminação F apresentou média de MAT significativamente (P<0,05) maior que as demais centrais. Considerando os padrões existentes, conclui-se que a água captada, purificada e armazenada apresentou boa qualidade microbiológica em todas as centrais de inseminação e não influenciou a média de mesófilos aeróbios totais das DIs preparadas. O incremento de bactérias, quando observado, foi provavelmente resultante da contaminação de origem ambiental durante o preparo do diluente e das doses inseminantes. / The water employed in the production of insemination doses (IDs) of swine may be one of the vehicles for introduction of contaminant bacteria, and can lead to their quality loss. The objective of this study was to assess the number of total aerobic mesophilic (TAM) in water used in swine artificial insemination centers (SAIC) and its influence in the total bacterial counting of the IDs produced. Three cycles of sampling were conducted in six SAIC (A-F) intentionally included in the study according to the following criteria: to be located in the south of Brazil, to produce > 1.000 (IDs) monthly, and to agree in participating of the study. At each cycle, samples were collected from water before the purification, water after passage through the purification system, water after storage, extenders, fresh semen collected from three different boars and the respective (ID) prepared with the semen and extender sampled. The water collected before the purification system was evaluated for total coliforms and Escherichia coli most probable number (NMP) in 100 mL using the multiple tubes technic. All samples collected were evaluated for the number of total aerobic mesophilic (TAM) by the pour plate technic. All the 18 samples of water collected before the purification presented < 1.1 NMP. 100 mL-1 of Escherichia coli. The average of TAM in the water samples varied between 0.1 log.CFU. ml-1 in the water after purification of the central E and 3.5 log. CFU.mL-1 in the water before purification of the central F. There was no significant difference (P>0.05) among the average counting of TAM obtained in different water samples types and among SAICs. The average TAM in samples of diluents varied from 0.16 log.CFU.mL-1 to 2.78 log.CFU.mL-1; the SAICs D and F presented diluents significantly (P< 0.05) more contaminated. Among the semen samples, the TAM average varied from 1.75 log.CFU.mL-1 to 3.79 log CFU.mL-1 and in the DIs between 0.73 log.CFU.mL-1 and 2.88 log.CFU.mL-1. The SAIC F presented average of TAM significantly (P<0.05) higher than the others SAICs. Considering the available standards, it was concluded that water collected, purified and stored presented a good microbiological quality in all insemination centers and did not influence the number of TAM in the prepared IDs. The increase on bacterial population may have resulted from contamination of environmental origin during the preparation of the extender and insemination doses.