Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Lia de Alencar Coelho / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Banca: César Roberto Esper / Banca: Gilson Helio Toniollo / Resumo: Os objetivos deste trabalho foram de facilitar os procedimentos de formação de gradientes de- densidade de Percoll e OptiPrep para separação de espermatozóides X; avaliar a eficiência da sexagem de espermatozóides X, a viabilidade espermática e integridade do acrossoma e do DNA após a centrifugação nestes gradientes e avaliar taxa de clivagem e blastocisto durante a produção in vitro de embriões. Para isso, doses de sêmen de touros foram descongeladas e cerca de 40 milhões de espermatozóides foram colocados sobre cada gradiente de densidade compostos por Percoll ou OptiPrep com três camadas que variaram entre 1.11 Og/mL a 1.123g/mL em tubos de poliestireno de 15mL. Centrifugou-se o gradiente a 500xg por 15 min a 22°C. Os sobrenadantes foram aspirados e recuperados para verificação da viabilidade espermática e integridade do acrossoma, fragmentação do DNA, produção in vitro de embriões, avaliação da eficiência da sexagem pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) e sexagem dos embriões pela PCR. A porcentagem de espermatozóides vivos com acrossoma intacto diminuiu (P<0,05) após a centrifugação nos gradientes de densidade, mas não influenciou, de modo geral, a produção in vitro de embriões (taxa de clivagem e blastocistos) utilizando estes espermatozóides centrifugados. Não foi detectada fragmentação do DNA dos espermatozóides nas amostras centrifugadas. Os resultados demonstraram que o Percoll enriqueceu as amostras com espermatozóides X (62% de fêmeas, P<0,05). No OptiPrep e grupo Controle a porcentagem de fêmeas foi de 47,1 e 48,7%, respectivamente. Estes resultados foram confirmados pela qPCR do DNA dos espermatozóides, com uma subestimação apenas no Percoll. Foi possível realizar a sexagem, por uma metodologia mais simples, facilitando o procedimento de centrifugação em gradiente de densidade e sem provocar danos aos espermatozóides. / Abstract: The objectives of this work were to facilitate the procedures of formation of density gradients of Percoll and OptíPrep for separation of X-bearing bovine spermatozoa; to evaluate the efficiency of sexing and viability of acrosome integrity and DNA after centrifugation in these gradients and to assess the cleavage and blastocyst rate during in vitro production of embryos. For this, frozen-thawed spermatozoa (20 to 40 millions) were deposited on each density gradient composed of Percoll or OptiPrep with three layers that varied between 1.110g/mL to 1.123g/mL, in 15mL polystyrene tubes. The tubes were centrifuged at 500xg for 15 min at 22oC. Supernatants were carefully aspirated and sediments recovered for verification of sperm quality, DNA fragmentation, in vitro fertilization of embryos, evaluation of the efficiency of sexing by real time polymerase chain reaction (qPCR) and sexing of embryos by PCR. Percentage of live spermatozoa with intact acrosome decreased (P<0.05) after centrifugation in density gradients, however, it not influence, in general, the production of embryos in vitro (cleavage and blastocyst rates) using these centrifuged sperm. No sperm DNA fragmentation was detected in centrifuged samples. The results of embryo sexing by PCR showed deviation to female in the Percoll group (62%, P<0.05). In the OptiPrep and Control group the percentage of females was 47.1 and 48.7%, respectively. These results were confirmed by qPCR of DNA of spermatozoa, with an underestimation only in the Percoll group. It was possible the sexing, by a simple approach, facilitating the process of the centrifugation in density gradient and without damage to sperm. / Doutor

Resumo: Algumas avaliações da capacidade de fecundação como a produção in vitro de embriões (PIV) e a coloração vital indicam que a sexagem de espermatozóides por centrifugação em gradiente de densidade pode causar diminuição nas taxas de desenvolvimento embrionário, entretanto, não são conclusivas quanto à avaliação da integridade das membranas espermáticas. Com o intuito de obter dados mais precisos em relação à viabilidade espermática pós-sexagem, foram descongeladas doses de sêmen de 6 touros diferentes, e avaliadas quanto aos danos espermáticos causados pela centrifugação em gradiente descontínuo de Percoll (com densidade variando de 1,111g/mL a 1,123g/mL). Antes e após a centrifugação dos espermatozóides, além das avaliações de concentração, motilidade e morfologia, o sêmen foi ainda avaliado quanto à integridade das membranas plasmáticas, acrossomal e mitocondrial pela associação das sondas fluorescentes: Iodeto de Propídio (PI), aglutinina de Pisum Sativum conjugado a Isotiocianato de flurosceína (FITC-PSA) e Iodeto de 5,5',6,6'-tetracloro- 1,1,3,3'-tetraetilbenzimidazolilcarbocianina (JC-1). Os resultados demonstraram que o processo de separação de espermatozóides X e Y por centrifugação em gradiente de densidade promoveu uma melhora nas características associadas à motilidade progressiva, além de uma significativa diminuição na incidência de defeitos maiores. Ainda nas amostras pós-centrifugação, foi observado um aumento no percentual de células com Membrana Plasmática Intacta e com Alto Potencial Mitocondrial. No entanto, o percentual de células com Membrana Acrossomal Intacta foi sensivelmente diminuída provavelmente devido ao fenômeno de reação acrossomal desencadeado pela centrifugação. / Abstract: Some fecundity evaluations as the in vitro embryo production (IVP) and the vital stains have indicating that the density gradients centrifugation techniques can reduce the embryo development rates. However they are not conclusive for the integrity of spermatic membranes. Wit the purpose of obtain more precise sperm viability data after the sexing procedure, frozen semen samples from six different bulls were thawed and assessed for spermatic damage caused by centrifugation in discontinuous Percoll gradient (with density varying from 1,111g/mL to 1,123g/mL). Before and after the separation of X-bearing bovine sperm, were evaluated the sperm concentration, motility and morphology. Moreover the semen samples were assessed for integrity of plasma, acrosome and mitochondrial membranes by fluorescent probes association: propidium iodide (PI), fluorescein isothiocyanate-Pisum sativum agglutinin (FITC-PSA) and 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine iodide (JC-1). The results demonstrated that the X-bearing sperm separation process by density gradient centrifugation caused an increase in the progressive motility parameters and a decrease in the major defects incidence. In addition, it was observed an increase in the cells categories with Intact Plasma Membrane and High Mitochondrial Membrane potential in the post-centrifugation samples. Nevertheless, the percentage of cells with Intact Acrossome Membrane was reduced probably due to the acrosome reaction phenomenon induced by centrifugation. / Orientadora: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Rubens Paes de Arruda / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Eneiva Carla Carvalho Celeghini / Mestre