Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia Veterinária, 2014. / Submitted by Guimaraes Jacqueline (jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-02T13:39:46Z No. of bitstreams: 1 2014_GeorgeHenriqueLimaMartins.pdf: 373385 bytes, checksum: 4a5dd41346725cd6e6e15dc9bd7a42a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-10-02T13:40:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_GeorgeHenriqueLimaMartins.pdf: 373385 bytes, checksum: 4a5dd41346725cd6e6e15dc9bd7a42a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-10-02T13:40:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_GeorgeHenriqueLimaMartins.pdf: 373385 bytes, checksum: 4a5dd41346725cd6e6e15dc9bd7a42a6 (MD5) Previous issue date: 2014-03-25 / O objetivo desse estudo foi avaliar o efeito da estimulação ovariana com o uso de FSH, sobre a maturação e competência, de ovócitos obtidos por aspiração transvaginal guiada por ultrassom, bem como sobre as taxas de clivagem e de produção de blastocisto na raça Sindi. Três tratamentos foram utilizados para produzir ovócitos parcialmente maturados in vivo, sendo T1 remoção do folículo dominante (RFD) com uso de doses múltiplas de FSH [RFD+FSH(m)], T2 remoção do folículo dominante e FSH em dose simples [RFD+FSH(s)] e TC ou grupo controle sendo realizada apenas a remoção do folículo dominante e Ovum Pick Up (OPU) [RFD-OPU]. Foram utilizadas 14 vacas cíclicas, vazias, não lactantes da raça Sindi, divididas em três grupos experimentais, sendo um para cada tratamento, sob regime de aspiração semanal, por período de cinco semanas. O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso. Os animais dos três grupos receberam um dispositivo intravaginal de progesterona no inicia de cada tratamento, sendo retirado no momento da OPU. O número de folículos aspirados por vaca não diferiu entre os grupos com FSH, havendo diferença estatística apenas entre os grupos T2 e TC, sendo T2 superir a TC (11,36±1,39; 12,52±1,81 e 8,7±0,74 respectivamente) (P<0,05). Para o número de Complexos Cumulus Ovócitos (CCOs) recuperados por vaca, T1 (9,76±1,32) e T2 (9,81±1,83) não diferiram entre si, mas ambos foram superiores a T3 (6,3±0,82) (P<0,05). O número de ovócitos maturados foi superior para os grupos com FSH, mas houve semelhança entre os grupos T1 e TC (6,72±1,04; 7,33±1,32 e 4,45±0,51) (P<0,05). Para taxa de clivagem e média de embriões produzidos não houve diferença significativa (P<0,05). Os tratamentos com FSH foram eficientes para melhorar o número de folículos aspirados, número de CCOs recuperados e o número de ovócitos maturados. Também foi observado nesses grupos um maior número de folículos de 3-8mm, mostrando uma eficiência na resposta estimulatória, porém os valores das taxas de clivagem (87%, 74% e 69%, respectivamente para T1, T2 e TC) e de blastocisto (33%, 35% e 32%, respectivamente para T1, T2 e TC) não diferiram entre si (P<0,05). O uso de FSH nos dois regimes de aplicação (única e múltipla aplicação) foi capaz de aumentar o número de folículos, o número de estruturas aptas à maturação, mas não foi eficaz em promover a aquisição da competência ovocitária refletida nas taxas de clivagem e de blastocisto. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The objective of this study was to evaluate the effect of ovarian stimulation using FSH before ovum pick up in Sindhi Cows to improve the maturation and competence of oocytes, as well as increase the cleavage rate and blastocyst production. Three treatments were used to induce in vivo oocyte maturation, T1 [DFR + FSH (m)]: Dominant follicle removal followed by multiple injection of FSH; T2 [DFR + FSH (s)] dominant follicle removal followed by single injection of FSH; T3 [DFR-OPU] dominant follicle removal and OPU. Fourteen non- pregnant and non lacting cycling Sindhi cows were used in a completely randomized experimental design. Animals were divided in three groups (T1, T2 e T3) and had their ovaries aspirated weekly for five consecutive weeks. At the begin of each week animals from three groups received an intravaginal progesterone device. The number of aspirated follicles per cow did not differ between the groups with FSH, but T2 group was statistically higher than T3 (11.36±1.39, 12.52±1.81 and 8.7±0.74, respectively for T1, T2 and T3), (P<0.05). The number of oocytes retrieved per cow was similar between T1 (9.76±1.32) and T2 (9.81±1.83) but lower in T3 (6.3±0.82), (P<0.05). The number of matured oocytes was higher for the groups with FSH, but there was similarity between DFR + FSH (m) and DFR-OPU (6.72±1.04, 7.33±1.32 and 4.45±0.51 matured oocytes, respectively), (P<0.05). There was no difference in the cleavage and blastocyt rates in all groups produced no significant difference (P<0.05). FSH treatments increased the number of follicles aspirated, number of oocytes retrieved and the number of matured oocytes. In these groups was also observed a greater number of follicles 3-8 mm than group without FSH, showing efficiency in stimulatory response. However, the cleavage rate (87%, 74% and 69% of cleavaged embryos, respectively to T1, T2 and T3) and blastocyst rate (33%, 35% and 32% of blastocyst to T1, T2 and T3) did not differ between the groups. The use of FSH multiple or single application was able to increase the number of follicles, the number of structures suitable for maturation, but was not effective in promoting the acquisition of oocyte competence, reflected in the cleavage and blastocyst rates.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2014. / Submitted by Cristiane Mendes (mcristianem@gmail.com) on 2014-11-19T19:12:47Z No. of bitstreams: 1 2014_EmanuelMouraoDoroteu.pdf: 581109 bytes, checksum: caa4de1424cfe656624b00f49713b66b (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-11-20T12:21:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_EmanuelMouraoDoroteu.pdf: 581109 bytes, checksum: caa4de1424cfe656624b00f49713b66b (MD5) / Made available in DSpace on 2014-11-20T12:21:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_EmanuelMouraoDoroteu.pdf: 581109 bytes, checksum: caa4de1424cfe656624b00f49713b66b (MD5) / A eficiência econômica da pecuária de corte está vinculada à produção de bezerros, sendo estes destinados à produção de carne ou reposição do rebanho. A fim de proporcionar uma segunda chance para as vacas que foram diagnosticadas como vazias na IATF, o uso da ressincronização tem sido difundido nas criações de gado de corte. O objetivo do presente estudo foi avaliar a eficiência do uso ou não do eCG na ressincronização em vacas Nelore pluríparas lactantes com intervalo de 35-75 dias pós parto, conhecer a interação entre dose, presença ou não de cio, presença ou não do corpo lúteo e taxa de prenhez. Foram utilizadas 775 fêmeas na primeira IATF e as vazias (449) 30 dias após, foram alocadas em 3 grupos homogêneos de forma equilibrada. O exame ultrassonográfico para observar a presença ou não de corpo lúteo foi realizado antes da primeira IATF e no momento da ressincronização. Todos os animais do experimento receberam o mesmo protocolo, porém com diferentes doses de eCG. No dia 0 foi inserido um dispositivo intravaginal novo com 1 g de progesterona (Sincrogest®, Ouro Fino, Brasil) e aplicação por via intramuscular de 2 mg de Benzoato de Estradiol (Sincrodiol®, Ouro Fino, Brasil). No dia 8 os dispositivos foram retirados e aplicado simultaneamente 1 mg de cipionato de estradiol (ECP®, Pfizer Saúde Animal, Brasil); 0,530 mg de Cloplostenol sódico (Sincrocio®, Ouro Fino, Brasil), Grupo-0 não recebeu eCG, Grupo-200 recebeu 200 UI de eCG (Folligon®, Intervet/Schering-Plough, Brasil) e o Grupo-300 recebeu 300 UI. Foi observado cio e todas as vacas foram inseminadas 48 horas após a retirada do dispositivo intravaginal. O diagnóstico de gestação foi realizado 30 dias após a inseminação artificial. Empregou-se o teste da razão de verossimilhança para determinar a importância de cada variável ou interação no modelo. Considerou-se significativo P < 0,05 e o programa SAS 9.3 foi empregado na análise. Para se comparar a proporção de vacas com corpos lúteos, usou-se o teste de McNemar. Nos animais que apresentaram cio após a retirada do dispositvo de progesterona, os diferentes tratamentos (0 UI, 200 UI, 300 UI de eCG) não alteraram ocorrência de prenhez. Além disso, as 2 doses de eCG não diferiram entre si em relação a taxa de prenhez. Nos animais que não apresentaram cio não existe diferença na ocorrência de prenhez entre o Grupo-200 e o Grupo-300. A porcentagem de vacas que tiveram o 1۔º corpo lúteo (16,26 %) é significativamente menor daquelas que tiveram o 2۔º corpo lúteo (67,26 %). A taxa acumulada de prenhez após 40 dias da estação de monta foi de 77,54%. De acordo com esse estudo as doses de 200 UI e 300 UI de eCG quando utilizadas na ressincronização 30 dias após a primeira IATF, não tiveram diferença na probabilidade de prenhez. A taxa cumulativa de prenhez em 40 dias de estação de monta viabiliza essa ferramenta como uma forma de otimizar o manejo reprodutivo nas fazendas de gado de corte. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The economic efficiency of livestock beef cattle is linked to the production of calves, which are destined for meat production or herd replacement. In order to provide a second chance for the cows that were diagnosed as not pregnant, the use of resynchronization has been widespread in livestock beef cattle. The objective of this study was to evaluate the efficiency of the use or not of eCG in resynchronization in lacting pluriparous Nelore cows with interval of 35-75 days postpartum, to understand the interaction between dose, presence or absence estrus, presence or absence of the corpus luteum and rate pregnancy. 775 cows were used in the first fixed-time artificial insemination (FTAI) and the not pregnancy (449) were used after 30 days, they were divided into 3 homogeneous groups in a balanced way. The ultrasonographic examination to observe the presence or absence of corpus luteum was performed before the first FTAI and the resynchronization moment. All the experimental animals received the same protocol, however with different doses of eCG. On the day 0 the cows received a new intravaginal device containing 1 g of progesterone (Sincrogest®, Ouro Fino, Brazil) and was administrated intramuscularly 2 mg of oestradiol benzoate (Sincrodiol®, Ouro Fino, Brazil). On the day 8 the devices were removed and was administrated IM 1 mg of oestradiol cypionate (ECP®, Pfizer Saúde Animal, Brazil), 0,530 mg cloplostenol sodium (Sincrocio®, Ouro Fino, Brazil), Group-0 did not received eCG, Group-200 did received 200 IU of eCG (Folligon®, Intervet / Schering-Plough, Brazil), and Group-300 did received 300 IU. Heat was observed and all the cows were inseminated 48 hours after the removal of the progesterone intravaginal device. Pregnancy diagnosis was performed 30 days after artificial insemination. The likelihood ratio test was applied to determine the importance of each variable or interaction model. The McNemar test was used to compare the proportion of cows with corpus luteum. In animals in estrus after withdrawal of progesterone device, the different treatments (0 IU, 200 IU, 300 IU eCG) did not alter the occurrence of pregnancy. Also the 2 doses of eCG did not differ in relation to pregnancy rate. In animals that did not show estrus there were no difference in incidence of pregnancy among the Group -200 and Group- 300. The percentage of cows that had the first corpus luteum (16.26%) is significantly lower than those who had the second corpus luteum (67.26 %). The cumulative pregnancy rate after 40 days of breeding season was 77.54 %. According to this study, doses of 200 IU and 300 IU eCG resynchronization when used in the first 30 days after FTAI, had no difference in the probability of pregnancy. The cumulative pregnancy rate at 40 days of breeding season enables this tool as a way to optimize the reproductive management of beef cattle farms.

A sexagem espermática tem um grande impacto na produção animal, pois permite a escolha do sexo dos descendentes, tendo o seu uso aumentado consideravelmente nos últimos anos. Atualmente, as taxas de blastocistos produzidos in vitro com sêmen sexado são semelhantes às com sêmen não sexado. Entretanto, quando utilizado na inseminação artificial (IA) e/ou transferência de embriões (TE) as taxas de gestação ou produção de embriões ainda são inferiores às obtidas com sêmen convencional. Esses resultados indicam que são necessários mais esclarecimentos sobre o efeito da sexagem nas células espermáticas. Este estudo teve o objetivo de avaliar possíveis alterações moleculares e funcionais dos espermatozoides causadas pelo processo de sexagem, além de tentar identificar diferenças entre espermatozoides contendo o cromossomo X ou Y. Para isto, um ejaculado de cada touro Nelore (n=4) foi colhido e separado em três frações: não sexado (NS), sexado X (SX) e sexado Y (SY), sendo utilizado em 3 experimentos. Nos experimentos 2 e 3, um quarto grupo foi formado pelo pool de espermatozoides sexados X e Y (XY). No primeiro experimento, utilizando a técnica de bisulfito de sódio, foi realizada a avaliação do padrão de metilação dos genes imprinted IGF2 e IGF2R em espermatozoides sexados e não sexados. No segundo experimento, foi avaliado o efeito da sexagem no tamanho e na forma da cabeça do espermatozoide e as possíveis diferença entre espermatozoides contendo cromossomo X ou Y. No último experimento, verificou-se o efeito da sexagem espermática na longevidade dos espermatozoides mantidos em meio de cultivo por 12 horas e na sua capacidade de se ligar às células da tuba uterina (CTU). No experimento relacionado à epigenética, não foi encontrada diferença no padrão de metilação dos genes IGF2 e IGF2R. Entretanto, identificou-se um polimorfismo no gene IGF2, e um padrão de metilação específico do gene IGF2R, provavelmente devido a uma característica epigenética especifica de animais Bos indicus. No experimento 2, não foi encontrada diferença em nenhuma das 23 variáveis estudadas entre os grupo X e Y. Entretanto, usando simultaneamente diversos parâmetros por meio de análise discriminante, na tentativa de diferenciar os grupos, o modelo mais discriminante atingiu 100% de precisão na identificação de espermatozoides de cada grupo NS, SX, SY e SXY. No experimento 3 foi identificado que o processo de sexagem afeta características estruturais da célula espermática, induzindo umacapacitação e reação acrossômica. Porém, ao longo de 12 horas de cultivo, a cinética dos espermatozoides sexados foi semelhante a do sêmen convencional. Além disto, foi identificado que o processo de sexagem comprometeu a capacidade dos espermatozoides de se manterem ligados às CTU. Em relação aos espermatozoides X e Y, foi observada uma menor capacidade do grupo X de se ligar às CTU, assim como uma diferença em características relacionadas à motilidade e acrossoma. Esses resultados podem contribuir no estabelecimento de procedimentos mais adequados para melhorar o aproveitamento e os resultados quando da utilização do sêmen sexado e em melhorias no processo de sexagem, ou mesmo no desenvolvimento de novas tecnologias para a separação de espermatozoides X ou Y. / Sperm sorting can have a great impact on breeding programs because it allows sex selection of the offspring, being its use increased considerably in last few years. Currently the rate of in vitro produced blastocyst using sexed sperm is similar to that obtained with no sexed sperm. However, lower rates of pregnancy and blastocyst are observed when sexed sperm are used for artificial insemination or embryo transfer compared to the conventional sperm. These results suggest that further studies are needed to clarify the effects of sexing process on sperm cells. This study aimed to evaluate molecular and functional changes caused by the sorting process, as well as to identify possible differences between sperm containing the X or Y chromosome. Each ejaculate of Nelore bulls (n=4) was collected and separated into three fractions: non-sexed (NS), sexed for X-sperm (SX), and sexed for Y-sperm (SY), being used in 3 experiments. For the experiment 2 and 3 a fourth group was formed by pooling SX and SY samples (SXY). On the first experiment, methylation pattern of the IGF2 and IGF2R imprinted gene in sexed and non sexed sperm was assessed using sodium bisulfite method. On the experiment 2, we evaluated whether sexing by flow cytometry changes the shape and size of the sperm head, and if these measurements differ between cells that bearing the X or Y chromosome. In the last experiment, the effect of sorting process on sperm longevity during 12 h incubation and their ability to bind to oviduct cells were evaluated. In the experiment related to methylation patterns, sex-sorting procedures have not affected DNA methylation patterns of the IGF2 and IGF2R genes. However, a polymorphism was found in IGF2 gene, and a very specific methylation patterns was observed in the IGF2R gene, probably due to an epigenetic characteristic in Bos indicus cattle. On experiment 2, no differences between X and Y sperm group were observed for any of the studied characteristics. However, using different parameters simultaneously in discriminator analysis, in an attempt to differentiate groups, the greatest discriminator model had 100% accuracy to identify the sperm from NS, SX, SY and SXY group. On experiment 3, it was identified that sorting process affected structural sperm characteristics, inducing a pre capacitation status and acrosome reaction. However, after 12 hours of incubation the kinetics of the sexed sperm was similar to the non sexed sperm. Furthermore, sexing process affected the ability of sperm to maintained bound to the oviduct cells. Regarding X and Y sperm, it was observed that X group had a lower ability to bind to the CTU, being the X sperm more susceptible to sorting process than the Y sperm. These results can contribute to improve the use and results of the sexed sperm, as well as to induce enhancements in the sexing process, or even to develop new technologies for separation of X or Y sperm cell.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2005Bitstream added on 2014-06-13T18:46:35Z : No. of bitstreams: 1 fernandes_ces_dr_botfmvz.pdf: 1119134 bytes, checksum: 2a9658153aec069a334942b772885d58 (MD5) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O presente estudo objetivou identificar o perfil eletroforético seminal, as características do espermograma e fertilidade in vitro, do sêmen de touros proveniente dos períodos pré e pós-indução do processo degenerativo testicular por insulação. Para isso, foram selecionados quatro animais da raça Nelore, com idade entre trinta e trinta e seis meses. Amostras de sêmen foram colhidas três dias antes (P0) da indução do processo degenerativo e, sete (P7), quatorze (P14) e vinte e um (P21) após a retirada do insulto testicular com cinco dias de duração. Para a análise dos dados foram considerados três experimentos: 1) efeito dos períodos experimentais (P0, P7, P14 e P21) sobre o espermograma e perfil eletroforético do plasma seminal e membrana plasmática dos espermatozóides; 2) efeito dos períodos experimentais e seleção espermática por gradiente de Percoll sobre as características seminais e 3) fertilidade in vitro e associação com características seminais oriundas do período pré e pósinsulto testicular. No experimento 1, os espermogramas foram avaliados por métodos convencionais, coloração de Fuelgen para estimativa do percentual de fragmentação nuclear (FN) e, perfil eletroforético do plasma seminal e espermatozóides por SDSPAGE a 12,5%... / The study was conducted to evaluate the seminal gel electrophoresis profile, spermogramme characteristics and in vitro fertility rate, of semen obtained before and after induction of the testicular degenerative process by scrotal insulation. Four Nelore bulls, between thirty and thirty-six months of age, were subjected to a five days scrotal insult. Semen samples were collected three days (P0) before scrotal insulation and seven (P7), fourteen (P14) and twenty-one (P21) days after the removal of the testicular insult. Three experiments were considered for data analysis: 1) effect of the experimental periods (P0, P7, P14 and P21) on the spermogramme and seminal plasma and plasmatic membrane of spermatozoa gel electrophoresis profile; 2) effect of the experimental periods and sperm selection by Percoll gradient on the seminal characteristics; and 3) in vitro fertility rate and association with seminal characteristics from periods before and after testicular insult. In the experiment 1, the spermogrammes were evaluated by conventional methods beside in the Fuelgen stain for nuclear fragmentation (NF) and proteins profile by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 12,5%)...

A sexagem espermática tem um grande impacto na produção animal, pois permite a escolha do sexo dos descendentes, tendo o seu uso aumentado consideravelmente nos últimos anos. Atualmente, as taxas de blastocistos produzidos in vitro com sêmen sexado são semelhantes às com sêmen não sexado. Entretanto, quando utilizado na inseminação artificial (IA) e/ou transferência de embriões (TE) as taxas de gestação ou produção de embriões ainda são inferiores às obtidas com sêmen convencional. Esses resultados indicam que são necessários mais esclarecimentos sobre o efeito da sexagem nas células espermáticas. Este estudo teve o objetivo de avaliar possíveis alterações moleculares e funcionais dos espermatozoides causadas pelo processo de sexagem, além de tentar identificar diferenças entre espermatozoides contendo o cromossomo X ou Y. Para isto, um ejaculado de cada touro Nelore (n=4) foi colhido e separado em três frações: não sexado (NS), sexado X (SX) e sexado Y (SY), sendo utilizado em 3 experimentos. Nos experimentos 2 e 3, um quarto grupo foi formado pelo pool de espermatozoides sexados X e Y (XY). No primeiro experimento, utilizando a técnica de bisulfito de sódio, foi realizada a avaliação do padrão de metilação dos genes imprinted IGF2 e IGF2R em espermatozoides sexados e não sexados. No segundo experimento, foi avaliado o efeito da sexagem no tamanho e na forma da cabeça do espermatozoide e as possíveis diferença entre espermatozoides contendo cromossomo X ou Y. No último experimento, verificou-se o efeito da sexagem espermática na longevidade dos espermatozoides mantidos em meio de cultivo por 12 horas e na sua capacidade de se ligar às células da tuba uterina (CTU). No experimento relacionado à epigenética, não foi encontrada diferença no padrão de metilação dos genes IGF2 e IGF2R. Entretanto, identificou-se um polimorfismo no gene IGF2, e um padrão de metilação específico do gene IGF2R, provavelmente devido a uma característica epigenética especifica de animais Bos indicus. No experimento 2, não foi encontrada diferença em nenhuma das 23 variáveis estudadas entre os grupo X e Y. Entretanto, usando simultaneamente diversos parâmetros por meio de análise discriminante, na tentativa de diferenciar os grupos, o modelo mais discriminante atingiu 100% de precisão na identificação de espermatozoides de cada grupo NS, SX, SY e SXY. No experimento 3 foi identificado que o processo de sexagem afeta características estruturais da célula espermática, induzindo umacapacitação e reação acrossômica. Porém, ao longo de 12 horas de cultivo, a cinética dos espermatozoides sexados foi semelhante a do sêmen convencional. Além disto, foi identificado que o processo de sexagem comprometeu a capacidade dos espermatozoides de se manterem ligados às CTU. Em relação aos espermatozoides X e Y, foi observada uma menor capacidade do grupo X de se ligar às CTU, assim como uma diferença em características relacionadas à motilidade e acrossoma. Esses resultados podem contribuir no estabelecimento de procedimentos mais adequados para melhorar o aproveitamento e os resultados quando da utilização do sêmen sexado e em melhorias no processo de sexagem, ou mesmo no desenvolvimento de novas tecnologias para a separação de espermatozoides X ou Y. / Sperm sorting can have a great impact on breeding programs because it allows sex selection of the offspring, being its use increased considerably in last few years. Currently the rate of in vitro produced blastocyst using sexed sperm is similar to that obtained with no sexed sperm. However, lower rates of pregnancy and blastocyst are observed when sexed sperm are used for artificial insemination or embryo transfer compared to the conventional sperm. These results suggest that further studies are needed to clarify the effects of sexing process on sperm cells. This study aimed to evaluate molecular and functional changes caused by the sorting process, as well as to identify possible differences between sperm containing the X or Y chromosome. Each ejaculate of Nelore bulls (n=4) was collected and separated into three fractions: non-sexed (NS), sexed for X-sperm (SX), and sexed for Y-sperm (SY), being used in 3 experiments. For the experiment 2 and 3 a fourth group was formed by pooling SX and SY samples (SXY). On the first experiment, methylation pattern of the IGF2 and IGF2R imprinted gene in sexed and non sexed sperm was assessed using sodium bisulfite method. On the experiment 2, we evaluated whether sexing by flow cytometry changes the shape and size of the sperm head, and if these measurements differ between cells that bearing the X or Y chromosome. In the last experiment, the effect of sorting process on sperm longevity during 12 h incubation and their ability to bind to oviduct cells were evaluated. In the experiment related to methylation patterns, sex-sorting procedures have not affected DNA methylation patterns of the IGF2 and IGF2R genes. However, a polymorphism was found in IGF2 gene, and a very specific methylation patterns was observed in the IGF2R gene, probably due to an epigenetic characteristic in Bos indicus cattle. On experiment 2, no differences between X and Y sperm group were observed for any of the studied characteristics. However, using different parameters simultaneously in discriminator analysis, in an attempt to differentiate groups, the greatest discriminator model had 100% accuracy to identify the sperm from NS, SX, SY and SXY group. On experiment 3, it was identified that sorting process affected structural sperm characteristics, inducing a pre capacitation status and acrosome reaction. However, after 12 hours of incubation the kinetics of the sexed sperm was similar to the non sexed sperm. Furthermore, sexing process affected the ability of sperm to maintained bound to the oviduct cells. Regarding X and Y sperm, it was observed that X group had a lower ability to bind to the CTU, being the X sperm more susceptible to sorting process than the Y sperm. These results can contribute to improve the use and results of the sexed sperm, as well as to induce enhancements in the sexing process, or even to develop new technologies for separation of X or Y sperm cell.

Orientador: Luis Antonio Violin Dias Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T03:55:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Arroteia_KelenFabiola_D.pdf: 15193315 bytes, checksum: b6b3930ea05ff1d7b858f560e01c178a (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O processo de fecundação em mamíferos depende de uma seqüência de eventos que culminam na ativação do oócito pelo espermatozóide. A diferenciação completa das células germinativas testiculares em células com capacidade fecundativa envolve testículos, epidídimos, ductos deferentes e trato reprodutor feminino. No epidídimo, a superfície dos espermatozóides pode sofrer diversas modificações, em um processo conhecido como maturação epididimária. Diversas proteínas sintetizadas e secretadas pelas células epiteliais do epidídimo serão posteriormente localizadas na superfície ou mesmo no interior da vesícula acrossômica do espermatozóide. A aquisição da capacidade de fertilização pelo spermatozóide tem sido correlacionada à esta nova organização das moléculas de membrana proporcionada durante o trânsito epididimário. A obtenção de anticorpos monoclonais que reconhecem os antígenos expressos pelas células germinativas testiculares durante seus processos contíguos de diferenciação, ou pelas células dos ductos pelos quais os espermatozóides transitam durante o processo de maturação tem constituído uma importante estratégia para permitir a geração de um mapa das moléculas que atuam na preparação do espermatozóide para a fecundação. O anticorpo monoclonal (Amc) TRA (testicular germ cells immunized to rat - monoclonal antibody) 54 reconhece um antígeno localizado em espermátides dos túbulos seminíferos de camundongos C57 BL/6 com idade superior a 24 dias pós-parto e também um antígeno expresso nas células epiteliais da cabeça do epidídimo e em espermatozóides da luz deste órgão. A molécula secretada percorre a luz do epidídimo no sentido ântero-posterior e, neste percurso, é incorporada pelos espermatozóides em trânsito. Com o intuito de contribuir para a compreensão dos complexos mecanismos que preparam o espermatozóide para a fecundação, o presente trabalho buscou identificar e reconhecer a estrutura protéica e a função biológica do antígeno reconhecido pelo Amc TRA 54 nas células epiteliais do epidídimo. No futuro, os resultados obtidos poderão contribuir com a geração de novas ferramentas clínicas para a solução de problemas relacionados à biologia da reprodução / Abstract: In mammals, fertilization depends on a sequence of events that culminates in the activation of the oocyte by the spermatozoa. The complete differentiation of the testicular germ cells in cells with fertilization ability involves the testis, epididymis, vas deferens and female reproductive organs. In the epididymis, the membrane surface of the spermatozoa may be modified, through a process known as epididymal maturation. Several proteins synthesized and secreted by the epididymal epithelial cells can be further located on the spermatozoa membrane surface or even though inside its acrosomal vesicle. The acquisition of the fertilization ability by the spermatozoa has been related with a new molecular organization of the membrane provided during the epididymal transit. The production of monoclonal antibodies (mAb) that recognizes antigens exclusively expressed by testicular germ cells or by the cells of the ducts through the spermatozoa passes during its maturation has been considered an important approach to permit the elaboration of the molecular map involved in the spermatozoa preparation. The mAb TRA (testicular germ cells immunized to rat - monoclonal antibody) 54 recognizes an antigen located in spermatids of seminiferous tubules of C57 BL/6 mice more than 24 days old and also in a specific population of epithelial cells in epididymal caput and in the luminal spermatozoa. The synthesis and release of the epididymal antigen occur in an androgen-dependent manner and independent of the testicular expression. Released antigen moves down the epididymis and is further incorporated by luminal spermatozoa. This work was performed in order to comprehend the complex mechanisms that prepare spermatozoa for the fertilization process. The molecular structure of the epididymal protein and its biological functions were investigated and solved. In a near future, the obtained results can contribute with new clinical tools for solving problems in reproductive biology / Doutorado / Histologia / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma ferramenta importante na reprodução animal, com aplicações acadêmicas e comerciais, e com grande relevância econômica. Apesar da sua aplicabilidade, a eficiência da PIVE ainda pode ser aumentada. Efeitos espermáticos podem ser evidenciados no desenvolvimento embrionário durante a PIVE apresentando grandes variações nas taxas de produção. Devido ao aspecto multifatorial da fertilidade, as avaliações espermáticas apresentam resultados inconstantes, mesmo com o uso de métodos mais precisos de análise como a citometria de fluxo, combinada às sondas fluorescentes, que permitem avaliar maior número de espermatozoides e de atributos simultaneamente. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de atributos espermáticos (motilidade antes e após gradiente de Percoll&reg;, integridade de membranas plasmática e acrossomal, alto potencial de membrana mitocondrial e resistência da cromatina) de maneira individual, (diferença para apenas para um atributo espermático) e de maneira combinada em perfis espermáticos (diferença para todos os atributos espermáticos simultaneamente). O efeito foi avaliado por meio das taxas de clivagem, blastocisto e eficiência de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivagem). Os resultados demonstraram que os atributos motilidade prévia ao Percoll&reg;, a integridade da membrana acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, individuais, apresentam efeito negativo sobre as taxas de desenvolvimento embrionário e de blastocisto. A motilidade após o gradiente de Percoll&reg;, a integridade da membrana plasmática e a resistência da cromatina, bem como a combinação de todos os atributos espermáticos analisados, sob mesmas condições, não apresentaram efeito sobre a PIVE. Deste modo, conclui-se que controversamente alguns atributos espermáticos podem apresentar efeitos negativos sobre as taxas da PIVE e que a função e interação de atributos espermáticos com o processo in vitro devem ser mais bem compreendidas, a fim de permitir o aprimoramento deste processo podendo aumentar as taxas de produção, maximizando a eficiência da PIVE. / In vitro production (IVP) of bovine embryos is an important technology of animal reproduction. This technology is applied on research and livestock, with economic highlights, however IVP efficiency could be higher, and can be influenced by male effects. Until now, sperm evaluations had failed to determine these male effects, even using advanced technologies such as large mix of fluorescent probes by flow cytometry analysis, which evaluates a large number of sperm cells and traits simultaneously. Then, the aim of this study was to determine the effect of sperm traits (motility before and after Percoll&reg; selection, plasma membrane and acrosome integrity, high mitochondrial membrane potential, and chromatin structure) on IVP rates. Effect of each trait was enriched to evaluate the individual trait effect (differences between groups of bulls exclusively for the enriched trait, while others traits was homogenous). Combined effect of traits was also evaluated (differences between groups of bulls, and groups of batches from same bulls, for all traits simultaneously, generating a sperm profile). Enriched and combined effects were evaluated on cleavage, blastocyst and embryo development (blastocyst/cleavage) rates. Results showed that motility before Percoll&reg; selection, acrosome integrity, and high mitochondrial membrane enriched effects had negative impact on blastocyst and embryo development rates. Motility after Percoll&reg; selection, plasma membrane integrity, chromatin structure, and combined effects were not significant on IVP rates. We can conclude that controversially, some sperm traits could have a negative effect on IVP outcomes, thereafter sperm traits physiology and interactions with in vitro systems must be better understood to enhance in vitro fertilization conditions, increasing IVP yields.

A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, sendo que alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos, sendo que os mais importantes são a apoptose, a deficiência de protamina e os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Os danos de DNA espermático não impedem que o espermatozóide fecunde o oócito, entretanto podem causar perda embrionária por apoptose. A importância da integridade da cromatina espermática no desenvolvimento embrionário já foi descrita em humanos, sendo que pode ser atribuída como uma das causas de infertilidade masculina, quando está alterada. Contudo, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e do desenvolvimento embrionário na espécie bovina são muito escassas. Devido à falta de informação sobre a relação da fragmentação de DNA e conseqüente alteração nos índices de desenvolvimento embrionário nessa espécie, este trabalho teve como objetivo avaliar o índice de fragmentação de DNA espermático em uma população de touros e verificar a influência dos possíveis danos de DNA espermático na produção in vitro (PIV) de embriões. Para isto, o sêmen congelado de 221 touros foi avaliado pelo ensaio de estrutura de cromatina espermática (SCSA). Após o ensaio, os animais foram divididos em seis grupos experimentais de acordo com o índice de fragmentação de DNA apresentado, sendo sete animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente para as avaliações espermáticas: motilidade, fragmentação de DNA espermático pelos ensaios SCSA e Cometa Alcalino e estresse oxidativo pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Posteriormente foi realizada a PIV de embriões, sendo avaliados os índices de clivagem e de blastocisto e realizado o ensaio de TUNEL para a avaliação da apoptose dos blastocistos produzidos. Em relação à motilidade espermática, o grupo 1 apresentou menor motilidade em relação ao grupo 4 (p<0,05). Não foi verificada diferença significativa da motilidade entre os outros grupos experimentais. O ensaio SCSA revelou que o grupo 1 apresentou menor susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático quando comparado com o grupo 5 (p< 0,05). O grupo 2 apresentou susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático inferior, quando comparado aos grupos 3, 4, 5 e 6 (p<0,05). Em relação ao ensaio Cometa Alcalino, a avaliação do estresse oxidativo e a PIV de embriões, não houve diferença significativa entre os grupos experimentais. Além disso, foi observada correlação negativa entre a intensidade média do Cometa e o índice de blastocisto produzido in vitro. O índice de blastocisto também apresentou correlação negativa com a intensidade média da cabeça do Cometa e ao ensaio TBARS. O ensaio TBARS apresentou correlação negativa com o índice de clivagem dos embriões PIV. Por outro lado, o ensaio TBARS apresentou correlação positiva com os ensaios SCSA e TUNEL. Considerando as condições experimentais, a fragmentação de DNA espermático não influenciou a PIV de embriões bovinos. / Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur for several reasons, and the most important are apoptosis, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS). The sperm DNA damage does not prevent the sperm to fertilize the oocyte, however it can cause embryonic loss by apoptosis. The importance of sperm chromatin integrity in embryonic development has been described in humans, and can be considered a cause of male infertility when it is disrupted. However, information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are very scarce. Due to the lack of information on the relationship between DNA fragmentation and its consequence on embryonic development rates in this species, this study aimed to evaluate the sperm DNA fragmentation rate in a population of bulls and the influence of possible sperm DNA damage on in vitro production (IVP). For this, frozen semen from 221 bulls was evaluated by sperm chromatin structure assay (SCSA). After that, animals were divided into six groups, according to the DNA fragmentation rate observed. Then seven animals from each group were randomly chosen for sperm evaluation: motility, sperm DNA fragmentation by the SCSA and Alkaline Comet assay and oxidative stress by tiobarbituric acid reactive substances (TBARS). After sperm evaluations embryo IVP was performed. Cleavage and blastocyst rates were assessed and the obtained blastocysts were submitted to TUNEL assay for apoptosis evaluation. Regarding sperm motility, group 1 had lower motility compared to group 4 (p <0.05). There was no significant difference in motility between the other experimental groups. The SCSA revealed that group 1 showed lower susceptibility to sperm DNA fragmentation when compared to group 5 (p <0.05). Group 2 was less susceptible to sperm DNA fragmentation, when compared to groups 3, 4, 5 and 6 (p <0.05). For the alkaline comet assay, the assessment of oxidative stress and embryo IVP, no significant difference was shown between en experimental groups. Moreover, there was a negative correlation between the comet mean intensity and the blastocyst rate. The blastocyst rate also negatively correlated to the comet head mean intensity and TBARS. The TBARS was negatively correlated to cleavage rate. In addition, TBARS correlated positively to TUNEL assay and SCSA. Considering the experimental conditions, the sperm DNA fragmentation did not influence the IVP of bovine embryos.

A produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é uma ferramenta importante na reprodução animal, com aplicações acadêmicas e comerciais, e com grande relevância econômica. Apesar da sua aplicabilidade, a eficiência da PIVE ainda pode ser aumentada. Efeitos espermáticos podem ser evidenciados no desenvolvimento embrionário durante a PIVE apresentando grandes variações nas taxas de produção. Devido ao aspecto multifatorial da fertilidade, as avaliações espermáticas apresentam resultados inconstantes, mesmo com o uso de métodos mais precisos de análise como a citometria de fluxo, combinada às sondas fluorescentes, que permitem avaliar maior número de espermatozoides e de atributos simultaneamente. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de atributos espermáticos (motilidade antes e após gradiente de Percoll&reg;, integridade de membranas plasmática e acrossomal, alto potencial de membrana mitocondrial e resistência da cromatina) de maneira individual, (diferença para apenas para um atributo espermático) e de maneira combinada em perfis espermáticos (diferença para todos os atributos espermáticos simultaneamente). O efeito foi avaliado por meio das taxas de clivagem, blastocisto e eficiência de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocisto/taxa de clivagem). Os resultados demonstraram que os atributos motilidade prévia ao Percoll&reg;, a integridade da membrana acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, individuais, apresentam efeito negativo sobre as taxas de desenvolvimento embrionário e de blastocisto. A motilidade após o gradiente de Percoll&reg;, a integridade da membrana plasmática e a resistência da cromatina, bem como a combinação de todos os atributos espermáticos analisados, sob mesmas condições, não apresentaram efeito sobre a PIVE. Deste modo, conclui-se que controversamente alguns atributos espermáticos podem apresentar efeitos negativos sobre as taxas da PIVE e que a função e interação de atributos espermáticos com o processo in vitro devem ser mais bem compreendidas, a fim de permitir o aprimoramento deste processo podendo aumentar as taxas de produção, maximizando a eficiência da PIVE. / In vitro production (IVP) of bovine embryos is an important technology of animal reproduction. This technology is applied on research and livestock, with economic highlights, however IVP efficiency could be higher, and can be influenced by male effects. Until now, sperm evaluations had failed to determine these male effects, even using advanced technologies such as large mix of fluorescent probes by flow cytometry analysis, which evaluates a large number of sperm cells and traits simultaneously. Then, the aim of this study was to determine the effect of sperm traits (motility before and after Percoll&reg; selection, plasma membrane and acrosome integrity, high mitochondrial membrane potential, and chromatin structure) on IVP rates. Effect of each trait was enriched to evaluate the individual trait effect (differences between groups of bulls exclusively for the enriched trait, while others traits was homogenous). Combined effect of traits was also evaluated (differences between groups of bulls, and groups of batches from same bulls, for all traits simultaneously, generating a sperm profile). Enriched and combined effects were evaluated on cleavage, blastocyst and embryo development (blastocyst/cleavage) rates. Results showed that motility before Percoll&reg; selection, acrosome integrity, and high mitochondrial membrane enriched effects had negative impact on blastocyst and embryo development rates. Motility after Percoll&reg; selection, plasma membrane integrity, chromatin structure, and combined effects were not significant on IVP rates. We can conclude that controversially, some sperm traits could have a negative effect on IVP outcomes, thereafter sperm traits physiology and interactions with in vitro systems must be better understood to enhance in vitro fertilization conditions, increasing IVP yields.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T18:29:37Z No. of bitstreams: 1 117110033.pdf: 882213 bytes, checksum: 12c52b9fad305c8e13e54eeab7fca3ac (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T18:29:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 117110033.pdf: 882213 bytes, checksum: 12c52b9fad305c8e13e54eeab7fca3ac (MD5) Previous issue date: 2013-04-26 / A centrifugação por gradiente de Percoll ® é o método mais utilizado para a seleção de sêmen bovino para a fecundação in vitro (FIV), no entanto, até o momento não existe nenhum estudo que indique uma força de centrifugação capaz de remover com sucesso o plasma seminal e outros constituintes, sem causar perdas na recuperação espermática ou danos funcionais aos espermatozoides obtidos no pellet. O presente estudo foi desenvolvido para verificar o efeito de diferentes forças de centrifugação na seleção espermática por gradientes de Percoll ® , através de avaliação de parâmetros de qualidade espermática e posterior desenvolvimento e qualidade de embriões bovinos produzidos in vitro (PIV). Parâmetros de estresse oxidativo também foram avaliados para verificar uma possível relação com os achados na avaliação de esperma. No experimento 1, amostras de sêmen de quatro touros foram homogeneizadas e submetidas a centrifugação em gradientes descontínuo de Percoll ® (30,60 e 90%) em diferentes forças: F1 (9000 X g), F2 (6500 X g), F3 (4500 X g) e F4 (2200 X g). No Experimento 2, as amostras de sêmen de cada touro foram processadas individualmente e centrifugadas em: F1 (9000 X g) e F4 (2200 X g). Todas as amostras espermáticas foram avaliadas quanto a concentração, motilidade, vigor, morfologia, espécies reativas de oxigênio (EROs) e integridade da membrana plasmática, sendo no experimento 2 avaliados ainda a peroxidação lipídica, defesas antioxidantes e desenvolvimento embrionário. Não foi observada diferença na concentração espermática nos sêmens submetidos a diferentes forças centrifugação. No Experimento 1, a percentagem de espermatozoides móveis foi superior (p <0,05) após centrifugação em F3 e F4 e a produção de EROs de F1 foi superior (p <0,05) em comparação com outras forças. No Experimento 2, quando o sêmen de cada touro foi processado individualmente, não foram observadas diferenças significativas nos parâmetros de qualidade espermática, peroxidação lipídica, defesas antioxidantes, taxa de clivagem e tempo médio da primeira clivagem entre F1 e F4. No entanto, o aumento da força de centrifugação reduziu a taxa de penetração e a fertilização normal (P<0,05). Este trabalho demonstrou pela primeira vez que a força de centrifugação de 2200 X g aumentou a penetração e a taxa de fecundação em relação à força de centrifugação habitual (9000 X g) utilizadas na separação de espermatozoides por gradientes descontínuos Percoll ® em bovinos. Estes resultados sugerem que esta força de centrifugação pode ser utilizada com sucesso na PIV de embriões bovinos, uma vez que não reduz a recuperação de espermatozoides e aumenta a taxa de fecundação. / Centrifugation by Percoll® gradient is the most widely used method in the preparation of bull sperm for the purpose of in vitro fertilization, however at the moment, no scientific study determined the best centrifugation speed to remove seminal plasma and other constituents, i.e. the speed at which the loss of sperm cells is minimized and where the spermatozoa in the pellet still remain functional. The present study was designed to examine the efficiency of different centrifugation forces in sperm separation Percoll by methods evaluating sperm quality parameters and subsequent development and quality of bovine in vitro production (IVP) embryos. Additionally, we evaluated oxidative stress parameters to verify a possible relationship with the findings in the sperm evaluation. In Experiment 1, the semen samples from each bull were pooled and submitted to centrifugation in discontinuous gradients Percoll (30,60 and 90%) at different forces: F1 (9000 X g), F2 (6500 X g), F3 (4500 X g) and F4 (2200 X g). In Experiment 2, the semen samples from each bull were done separately and submitted to: F1 (9000 X g) and F4 (2200 X g). All sperm samples were evaluated to the concentration, motility, vigor, morphology, reactive oxygen species (ROS) and integrity of the plasma membrane, and in experiment 2 also were evaluated lipid peroxidation, antioxidants assays and embryo development. No difference was observed in the concentration of sperm submitted to different centrifugation forces. In Experiment 1, the total percentage of motile sperm was increased (p < 0.05) after centrifugation in F3 and F4 and the ROS production to F1 was superior (p < 0.05) compared to other forces. In Experiment 2, when the bull semen was processed individually, no significant difference was observed in the sperm quality parameters assessment, lipid peroxidation, antioxidants assays, cleavage rate and average time of the first cleavage between F1 and F4, sires or interaction between them after Percoll. However, the increased force centrifugation reduced the rate of penetration and normal fertilization (P < 0.05). This work demonstrated for the first time that 2200 X g centrifugation force enhanced the penetration and fertilization rates in relation to usual centrifugation force (9000 X g) using sperm separation by discontinuous Percoll gradients in bovine. These findings suggest that this centrifugation force could be used with successful in the bovine IVP embryo since it does not reduce sperm recuperation and increases the fecundation rate.