Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-03-08T20:08:58Z No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-08T20:08:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 127110020.pdf: 531553 bytes, checksum: 0170d654c8a7662821baf128927374e8 (MD5) Previous issue date: 2014-08-12 / A técnica de seleção espermática para fecundação in vitro (FIV) deve proporcionar além, da recuperação eficiente de espermatozoides, a manutenção da integridade celular. Diversos métodos vêm sendo propostos para a seleção de espermatozoides bovinos destinados a FIV, sendo o método de centrifugação em gradientes de densidade descontínuos de Percoll® o mais utilizado. Em bovinos esta técnica de seleção vem sendo amplamente modificada no que se refere ao volume, número de gradientes, tempo e força de centrifugação, visando aumentar a recuperação espermática, proporcionando um melhor rendimento da dose. Contudo, a etapa de centrifugação, presente nestes protocolos, pode causar danos irreversíveis aos espermatozoides e assim influenciar nas taxas de fecundação. O presente estudo teve como objetivo determinar a influência da força e do tempo de centrifugação, assim como a associação do meio Cushion Fluid® na segunda centrifugação na seleção espermática por gradientes de Mini Percoll® modificado, através da avaliação de características morfofuncionais, formação de espécies reativas ao oxigênio (EROs), defesas antioxidantes, taxa de fecundação in vitro e desenvolvimento embrionário em três experimentos. No experimento I, um pool contendo sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foi submetido ao método de separação por Mini Percoll®, sendo as amostras divididas em quatro grupos e submetidos a duas forças (2200 ou 9000 X g) e dois tempos de centrifugação (1 e 3 minutos). No experimento II e III, um pool de sêmen de dois touros Bos taurus taurus com fertilidade conhecida foram processados pelo método de Mini Percoll® modificado, sendo adicionado uma quantidade de 150μL de Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) durante a segunda centrifugação. Foram realizadas avaliações morfofuncionais e bioquímicas das amostras do sêmen destinado a FIV, assim como a capacidade fecundante e o desenvolvimento embrionário dos oócitos fecundados com os espermatozoides selecionados. No primeiro experimento foi observada uma melhora no vigor dos espermatozoides após o gradiente de Mini Percoll®, para todos os tratamentos. No segundo experimento, a taxa de recuperação espermática não diferiu entre os tratamentos, sendo 42,0% ± 4,9 para T1 e 38,6% ± 3,6 para T2 (grupo com adição do Cushion Fluid® na segunda centrifugação):. Na morfologia espermática o T2 (5,1 ± 1,1) apresentou menor taxa de espermatozoides com defeitos maiores do que os tratamentos T0 (Pré-Percoll) e T1 (8,8 ± 0,8 e 5,8 ± 1,0). Neste mesmo experimento, os níveis de EROs apresentaram-se aumentados (P < 0,05) no meio com Cushion Fluid® (T2), no entanto, a avaliação das defesas antioxidantes não diferiram entre os tratamentos. No experimento III, não foram observadas diferenças na taxa de fecundação. Este trabalho demonstrou que o uso de uma menor força e tempo (2200 X g/1 min.) de centrifugação pode ser utilizado sem interferir nas taxas de recuperação espermática. O uso do meio Cushion Fluid® durante a centrifugação de espermatozoides bovinos não influenciou a taxa de fecundação e desenvolvimento embrionário até 48 horas. / The technique of sperm selection for in vitro fertilization (IVF) should provide addition, the sperm efficient recovery, the maintenance of cellular integrity. Several methods have been proposed for bovine sperm selection for IVF, and the discontinuous density gradients Percoll® ( Sigma Aldrich – St. Louis MO, USA) centrifugation method on the most used. In cattle this selection technique has been extensively modified with respect to the volume, number of gradients, time, and centrifugal force, to increase the sperm recovery, providing a better yield of the dose. However, the centrifugation step present in these protocols, may cause irreversible damage to sperm and thus influence fertilization rate. The present study aimed to determine the influence of centrifugation force and time, as well as the association of the Cushion Fluid® centrifugation on sperm selection by gradients Mini Percoll® modified by evaluating morphological and functional characteristics, ROS formation, antioxidant defenses, rate of in vitro fertilization and embryo development. Three experiments carry out. In experiment I, a pool containing two semen Bos taurus taurus bulls was subjected Mini Percoll® separation method, samples being divided into four groups, with two centrifugal forces (2200 or 9000 X g) and two times (1 and 3 min). In experiment II and III, the pool has been processed by the Mini Percoll® modified method, being added to an amount of 150μLix of Cushion Fluid® (Minitübe, Tiefenbach, Germany) in the second centrifugation in the treated group. Morphofunctional and biochemical evaluation of semen samples for IVF, as well as the fertilizing capacity and embryo development of oocytes fertilized with sperms were selected performed. In the first experiment an improvement was observed in the vigor of sperm after gradient Mini Percoll® for all treatments. In the second experiment, the recovery rate sperm did not differ between treatments (T1: 42.0 ± 4.9 and T2 (with adding Cushion Fluid® the second centrifugation): 38.6 ± 3.6). In sperm morphology T2 (5.1 ± 1.1) showed a lower sperm rate with major defects than T0 (Pre-Percoll) and T1 (8.8 ± 0.8 and 5.8 ± 1.0 treatments ). In this same experiment, ROS levels were presented increased (P <0.05) in the medium with Cushion Fluid® (T2), however, the evaluation of antioxidant defenses did not differ between treatments. In experiment III, no differences in fertilization rate were observed. This study demonstrated that the use of a smaller force and time (2200 X g / 1 min.) to centrifugation can be used without interfering with the sperm recovery rate. The use of the medium Cushion Fluid® during centrifugation of bovine sperm did not influence the fertilization rate and embryo development to 48 hours.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-07-23Bitstream added on 2014-06-13T18:58:53Z : No. of bitstreams: 1 prado_rb_me_jabo.pdf: 511369 bytes, checksum: 2d3f3a38c03cdc40b94b303e51f07eb6 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O processo de criopreservação afeta a capacidade funcional dos espermatozóides, diminuindo a fertilidade. Tendo conhecimento desses danos a diluição do sêmen é necessária antes de submetê-lo ao choque térmico. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sêmen bovino congelado com dois diferentes diluidores. O ejaculado de quatro touros foi dividido em duas partes iguais, uma delas submetida ao diluidor Tris e gema de ovo (A) e a outra ao diluidor à base de lecitina de soja (Andromed®) (B). Após a diluição o sêmen foi congelado e armazenado em nitrogênio líquido de acordo com os padrões pré-estabelecidos da central de inseminação artificial. No experimento I, cinco palhetas do diluidor A e B de cada touro foram descongeladas e avaliadas quanto à motilidade (análise subjetiva e computadorizada), vigor, concentração, morfologia espermática e teste de termo-resistência lento (TTL), avaliação da integridade de membranas por meio da associação das sondas Iodeto de Propídio (PI), Isotiocionato de Fluoresceína - Pisum sativum (FITC-PSA) e Carbocianina Catiônica Lipofílica (JC-1) e avaliação funcional da membrana plasmática através do teste hiposmótico (HIPO). A avaliação da integridade da cromatina foi realizada pelo método de coloração com laranja de acridina (LA). No experimento II, o sêmen congelado com os diferentes diluidores foi utilizado na fecundação in vitro (FIV), sendo observada as taxas de clivagem e desenvolvimento embrionário in vitro. A análise estatística foi efetuada através dos testes de Análise de Variância (ANOVA), teste de Tukey e teste de Wilcoxon. Em relação aos resultados obtidos com os experimentos I e II não foi observado diferença estatística entre os diluidores testados, concluindo-se que o diluidor composto por lecitina... / Nowadays the embryo transfer is a biotechnology widely used, however not much is know about the best place to put embryos into the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum (CL). In addition, not much is known about the morphological characteristics thorough the uterine horn and if it could improve or damage the uterine environment. The aims of this study were: to investigate the effect of the site of embryo placement (cranial, medial or caudal) into the uterine horn adjacent to the CL on pregnancy rates; to analyze the morphology from these tree portions of the both uterine horns adjacent and opposite to CL using histology and scanning electron microscopy; and establish the relation between pregnancy rates and morphofunctions characteristics to indicate the best place to transfer embryos. In this study 600 in vivo produced embryos (fresh and frozen-thawed) and 315 in vitro produced embryos were transferred to Holstein and crossbred recipients, in order. Nine crossbred heifers were slaughtered approximately seven days after estrus and the uterus were studied to analyze its morphology at the same time that the embryos have been transferred. The results showed that the site of embryo placement did not influence (P>0.05) the pregnancy rates in recipients receiving fresh embryos during summertime. During the winter, the pregnancy rates were greater (P<0.05) for fresh embryos transferred into the caudal portion of the uterus horn than cranial portion. For animals that received in vitro produced embryo, the site of embryo placement did not interfere (P>0.05) in the pregnancy rates. Morphophological characteristics observed by histology and scanning electron microscopy was similar in all parts of the uterine horn ipsilateral to the CL studied. However, the average number of blood vessels counted was lower in the contralateral uterine... (Complete abstract click electronic access below)

Resumo: O presente estudo objetivou identificar o perfil eletroforético seminal, as características do espermograma e fertilidade in vitro, do sêmen de touros proveniente dos períodos pré e pós-indução do processo degenerativo testicular por insulação. Para isso, foram selecionados quatro animais da raça Nelore, com idade entre trinta e trinta e seis meses. Amostras de sêmen foram colhidas três dias antes (P0) da indução do processo degenerativo e, sete (P7), quatorze (P14) e vinte e um (P21) após a retirada do insulto testicular com cinco dias de duração. Para a análise dos dados foram considerados três experimentos: 1) efeito dos períodos experimentais (P0, P7, P14 e P21) sobre o espermograma e perfil eletroforético do plasma seminal e membrana plasmática dos espermatozóides; 2) efeito dos períodos experimentais e seleção espermática por gradiente de Percoll sobre as características seminais e 3) fertilidade in vitro e associação com características seminais oriundas do período pré e pósinsulto testicular. No experimento 1, os espermogramas foram avaliados por métodos convencionais, coloração de Fuelgen para estimativa do percentual de fragmentação nuclear (FN) e, perfil eletroforético do plasma seminal e espermatozóides por SDSPAGE a 12,5%... / Abstract: The study was conducted to evaluate the seminal gel electrophoresis profile, spermogramme characteristics and in vitro fertility rate, of semen obtained before and after induction of the testicular degenerative process by scrotal insulation. Four Nelore bulls, between thirty and thirty-six months of age, were subjected to a five days scrotal insult. Semen samples were collected three days (P0) before scrotal insulation and seven (P7), fourteen (P14) and twenty-one (P21) days after the removal of the testicular insult. Three experiments were considered for data analysis: 1) effect of the experimental periods (P0, P7, P14 and P21) on the spermogramme and seminal plasma and plasmatic membrane of spermatozoa gel electrophoresis profile; 2) effect of the experimental periods and sperm selection by Percoll gradient on the seminal characteristics; and 3) in vitro fertility rate and association with seminal characteristics from periods before and after testicular insult. In the experiment 1, the spermogrammes were evaluated by conventional methods beside in the Fuelgen stain for nuclear fragmentation (NF) and proteins profile by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE, 12,5%)... / Orientador: Antonio Emídio Dias Feliciano da Silva / Coorientador: Margot Alves Nunes Dode / Doutor

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-11T19:23:04Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-12T09:28:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-12T09:28:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Jane Porfírio Rocha - 2004.pdf: 370129 bytes, checksum: b81520b5ddabb24c93613beb9a4564e1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2004-03-01 / Studied in this work maturation in vitro oocytes collected from ovaries obtained from a slaughterhouse, without any hormonal stimulation and, comparing these data at different stages of maturation between heifers and old cows. The culture medium used for maturation was the In Vitro Fertilization (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), where similar results were observed for the two age, presenting a significant correlation (r = 0.9991 and p <0.0001) for stages of maturation, despite the maturing rate for new cows have better 50.5%, and for the old cows of 31.3%, there was no statistical difference. The same is repeated for the fertilization of young cows to 98.1% and 86% for old cows. For the blastocyst formation rate, 17.14% to 22.58% and old cows to young cows. We tested two types of cryopreservation for embryos in the blastocyst stage, the ultra-fast freezing, using dimethyl sulfoxide-cryoprotector (DMSO), and the computerized slow freezing with cryo chambers - Australian, using glycerol as cryoprotector. Embryos at the new cows DMSO showed a 14% survival rate and 73% glycerol, and the old cows were 31% DMSO and 63% glycerol. The rehydration rate of re-expansion of blastocysts after thawing was 15% with 15% DMSO and 38% glycerol for old cows and 14% DMSO and 55% glycerol for new cows. Spontaneous Hatching was observed only for the embryos thawed freezing with glycerol for young cows. In the statistical calculation was no significance between the results of survival, to total frozen and thawed embryos, between the slow freezing methods and the ultra-fast slow cryopreservation method using glycerol as a cryoprotector. / Estudou-se neste trabalho a maturação de oócitos in vitro, coletados de ovários obtidos em abatedouro, sem qualquer tipo e estimulação hormonal, comparando estes dados em seus diferentes estágios de maturação entre novilhas e vacas velhas. O meio de cultura utilizado para a maturação foi o In Vitro Fertilization (Scandinavian IVF Science AB. Sweden), onde se observou resultados similares para as duas idades, apresentando uma correlação significativa (r = 0,9991 e p < 0,0001) para os estágios de maturação, apesar da taxa de maturação para as vacas novas se apresentarem melhores 50,5%, e para as vacas velhas de 31,3%, não houve diferença estatística. O mesmo se repete para a taxa de fertilização de 98,1% para vacas novas e 86% para vacas velhas. Para a taxa de formação de blastocisto, 17,14% para vacas velhas e 22,58% para vacas novas. Foram testados dois tipos de criopreservação para embriões em estágio de blastocisto, o congelamento ultra-rápido, usando o crioprotetor dimetil-sufóxido (DMSO), e o congelamento lento computadorizado com criocâmara - Australiana, usando glicerol como crioprotetor. Os embriões das vacas novas pelo DMSO apresentaram uma taxa de sobrevida de 14% e com glicerol de 73%, e para as vacas velhas foram de 31% com DMSO e 63% com glicerol. As taxas de reidratação de re-expansão do blastocisto pós-descongelamento foram de 15% com 15% com DMSO e 38% com glicerol para vacas velhas e 14% com DMSO e 55% com glicerol para vacas novas. O Hatching espontâneo foi observado apenas para os embriões descongelados do congelamento com glicerol para vacas novas. No calculo estatístico houve significância entre os resultados de sobrevida, para o total de embriões congelados e descongelados, entre os métodos de congelamento lento e o ultra-rápido método de criopreservação lento, usando o glicerol como crioprotetor.

A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, sendo que alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos, sendo que os mais importantes são a apoptose, a deficiência de protamina e os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Os danos de DNA espermático não impedem que o espermatozóide fecunde o oócito, entretanto podem causar perda embrionária por apoptose. A importância da integridade da cromatina espermática no desenvolvimento embrionário já foi descrita em humanos, sendo que pode ser atribuída como uma das causas de infertilidade masculina, quando está alterada. Contudo, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e do desenvolvimento embrionário na espécie bovina são muito escassas. Devido à falta de informação sobre a relação da fragmentação de DNA e conseqüente alteração nos índices de desenvolvimento embrionário nessa espécie, este trabalho teve como objetivo avaliar o índice de fragmentação de DNA espermático em uma população de touros e verificar a influência dos possíveis danos de DNA espermático na produção in vitro (PIV) de embriões. Para isto, o sêmen congelado de 221 touros foi avaliado pelo ensaio de estrutura de cromatina espermática (SCSA). Após o ensaio, os animais foram divididos em seis grupos experimentais de acordo com o índice de fragmentação de DNA apresentado, sendo sete animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente para as avaliações espermáticas: motilidade, fragmentação de DNA espermático pelos ensaios SCSA e Cometa Alcalino e estresse oxidativo pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Posteriormente foi realizada a PIV de embriões, sendo avaliados os índices de clivagem e de blastocisto e realizado o ensaio de TUNEL para a avaliação da apoptose dos blastocistos produzidos. Em relação à motilidade espermática, o grupo 1 apresentou menor motilidade em relação ao grupo 4 (p<0,05). Não foi verificada diferença significativa da motilidade entre os outros grupos experimentais. O ensaio SCSA revelou que o grupo 1 apresentou menor susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático quando comparado com o grupo 5 (p< 0,05). O grupo 2 apresentou susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático inferior, quando comparado aos grupos 3, 4, 5 e 6 (p<0,05). Em relação ao ensaio Cometa Alcalino, a avaliação do estresse oxidativo e a PIV de embriões, não houve diferença significativa entre os grupos experimentais. Além disso, foi observada correlação negativa entre a intensidade média do Cometa e o índice de blastocisto produzido in vitro. O índice de blastocisto também apresentou correlação negativa com a intensidade média da cabeça do Cometa e ao ensaio TBARS. O ensaio TBARS apresentou correlação negativa com o índice de clivagem dos embriões PIV. Por outro lado, o ensaio TBARS apresentou correlação positiva com os ensaios SCSA e TUNEL. Considerando as condições experimentais, a fragmentação de DNA espermático não influenciou a PIV de embriões bovinos. / Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur for several reasons, and the most important are apoptosis, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS). The sperm DNA damage does not prevent the sperm to fertilize the oocyte, however it can cause embryonic loss by apoptosis. The importance of sperm chromatin integrity in embryonic development has been described in humans, and can be considered a cause of male infertility when it is disrupted. However, information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are very scarce. Due to the lack of information on the relationship between DNA fragmentation and its consequence on embryonic development rates in this species, this study aimed to evaluate the sperm DNA fragmentation rate in a population of bulls and the influence of possible sperm DNA damage on in vitro production (IVP). For this, frozen semen from 221 bulls was evaluated by sperm chromatin structure assay (SCSA). After that, animals were divided into six groups, according to the DNA fragmentation rate observed. Then seven animals from each group were randomly chosen for sperm evaluation: motility, sperm DNA fragmentation by the SCSA and Alkaline Comet assay and oxidative stress by tiobarbituric acid reactive substances (TBARS). After sperm evaluations embryo IVP was performed. Cleavage and blastocyst rates were assessed and the obtained blastocysts were submitted to TUNEL assay for apoptosis evaluation. Regarding sperm motility, group 1 had lower motility compared to group 4 (p <0.05). There was no significant difference in motility between the other experimental groups. The SCSA revealed that group 1 showed lower susceptibility to sperm DNA fragmentation when compared to group 5 (p <0.05). Group 2 was less susceptible to sperm DNA fragmentation, when compared to groups 3, 4, 5 and 6 (p <0.05). For the alkaline comet assay, the assessment of oxidative stress and embryo IVP, no significant difference was shown between en experimental groups. Moreover, there was a negative correlation between the comet mean intensity and the blastocyst rate. The blastocyst rate also negatively correlated to the comet head mean intensity and TBARS. The TBARS was negatively correlated to cleavage rate. In addition, TBARS correlated positively to TUNEL assay and SCSA. Considering the experimental conditions, the sperm DNA fragmentation did not influence the IVP of bovine embryos.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_alexander_de_oliveira_goncalves.pdf: 291520 bytes, checksum: b6ebcc42cb32615e466fb7da14f76006 (MD5) Previous issue date: 2013-02-22 / The bovine in vitro embryo production (IVEP) showed a great expansion in last decades, but, various factors concours to low embryo production rates. This paper aimed to determine the influence of cryoprotector and sperm selection gradient on super recuperation rate and sperm integrity, including the rate of IVEP. The ejaculate of a bull with high FIV rates was divided; one part was frozen with 5% glycerol (GLY) and the other with 3% of ethylene glycol (EG). At sperm selection each group was centrifuged at 5000 x g/5min in discontinuous Percoll® (MP; 90 e 45%) and OptiPrep® (MO; 30 e 26%) mini gradients (600μl), forming four experimental groups: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Motility, agglutination, recuperation rate, membrane integrity (MI), acrosome integrity (AI) and mitochondrial activity (MA) were evaluated pre- and post-sperm selection. Embryo production rates were accessed at cleavage, D7 and D8. At thawing there was no difference (P>0,05) on sperm motility (GLY - 78.6% ± 6,9 and EG - 75.7%± 5,3) and no sperm agglutination was detected. After sperm selection motility and sperm recuperation were different (P<0,05) between the groups GLY/MP; EG/MP e GLY/OP; EG/OP (82.9 ± 7.6 e 46.5 ± 13.8; 81.4 ± 9,0 and 44.3 ± 16.3 vs. 27.1 ± 4.9 e 23.1 ± 7.4; 31,4 ± 6.9 e 29.8 ± 12.4, respectively). On the other hand, there were no difference (P>0,05) between groups in sperm structural integrity after thawing and after sperm selection. The cleavage rate of GLY/MP and EG/MP groups were higher (P<0,05) than GLY/OP and EG/OP (66.1 ± 8.1 e 60.6 ± 14.2 vs. 41.6 ± 7.9 e 48.5 ± 7.5, respectively). At D7 blastocyst rates of GLY/MP group was superior (P<0,05) than GLY/MO, but similar (P>0,05) to EG/MP group, which do not differ (P>0,05) from EG/MO. At this moment only EG/MO do not differ (P>0,05) from GLY/MO. EG/MP, EG/MO and GLY/MO groups presented similar (P>0,05) embryo production rates at D8. In conclusion, the cryoprotectant do not interfere in the evaluated sperm and embryo parameters, and Percoll® mini - gradient provided better embryo production rates than OptiPrep® mini-gradient. / A PIV de embriões bovinos é a biotécnica de reprodução assistida que apresentou o maior crescimento nas últimas décadas, entretanto, vários fatores podem concorrer no comprometimento dos resultados. Este trabalho objetivou determinar a influência do crioprotetor e do gradiente de seleção espermática sobre a recuperação e integridade dos espermatozoides e a taxa de PIV de embriões bovinos. Inicialmente, um ejaculado de um touro reconhecidamente eficiente na FIV foi dividido em duas frações, uma delas congelada com 5% de glicerol (GLI) e a outra com 3% de etilenoglicol (EG). No momento da seleção espermática, cada grupo foi centrifugado a 5000 x g/5min em mini gradientes descontínuos de Percoll® (MP; 90 e 45%) ou OptiPrep® (MO; 30 e 26%) usando o método de volume reduzido (600μl), constituindo quatro grupos experimentais: GLI/MP; EG/MP; GLI/OP e EG/OP. Foram realizadas avaliações espermáticas pré e pós seleção espermática de motilidade, aglutinação, recuperação, integridade de membrana (IM), integridade de acrossoma (IA) e funcionalidade mitocondrial (FM). Com relação à produção embrionária, foram avaliados os parâmetros de clivagem, desenvolvimento embrionário no dia 7 (D7) e no dia 8 (D8). Na avaliação espermática ao descongelamento as taxas de motilidade observadas foram semelhantes (P>0,05) entre os grupos GLI (78,6 ± 6,9) e EG (75,7 ± 5,3). Nesse momento também não foi detectada aglutinação espermática nas amostras dos dois tratamentos. Pós-seleção espermática foi encontrada diferenças para motilidade e recuperação espermática entre os grupos, GLI/MP; EG/MP e GLI/OP; EG/OP (82,9 ± 7,6 e 46,5 ± 13,8; 81,4 ± 9,0 e 44,3 ± 16,3 vs. 27,1 ± 4,9 e 23,1 ± 7,4; 31,4 ± 6,9 e 29,8 ± 12,4, respectivamente). Não foram encontradas diferenças nas avaliações de integridade estrutural dos espermatozoides pósdescongelamento e pós-seleção espermática em nenhum dos grupos testados (P>0,05). Nas avaliações de produção embrionária os grupos GLI/MP e EG/MP foram superiores (P<0,05) para clivagem do que os grupos GLI/OP e EG/OP (66,1 ± 8,1 e 60,6 ± 14,2 vs. 41,6 ± 7,9 e 48,5 ± 7,5, respectivamente). No D7, as taxas de produção de blastocistos obtidas no grupo GLI/MP foram maiores (P<0,05) do que no GLI/MO, mas foram semelhantes (P>0,05) ao EG/MP, que por sua vez, não diferiu (P>0,05) do EG/MO. Neste momento, apenas o EG/MO não diferiu (P>0,05) do GLI/MO. No D8, os grupos EG/MP, EG/MO e GLI/MO foram semelhantes (P>0,05). Conclui-se que o crioprotetor utilizado no congelamento de sêmen não interfere em nenhuma das avaliações espermáticas e de desenvolvimento embrionário e que o método de seleção espermática usando o mini gradiente OptiPrep® afeta a motilidade e recuperação espermática proporcionando menor taxa de produção embrionária do que quando se utiliza o mini gradiente Percoll®.

O sucesso da fecundação e da sustentação do desenvolvimento embrionário subseqüente é dependente de atributos espermáticos relacionados à qualidade seminal. A produção in vitro de embriões em bovinos é uma ferramenta fundamental para a aceleração do ganho genético do rebanho, porém o uso comercial depende diretamente da melhoria do sistema de produções in vitrode embriões a um baixo custo. Técnicas que proporcionem melhoria da qualidade seminal possibilitando um incremento na produção in vitro de embriões e ainda a um baixo custo possuem apelo econômico. O laser de baixa potência emite ondas eletromagnéticas com efeitos biológicos. Este efeito é dependente dos parâmetros de irradiação e do tipo celular alvo. Trabalhos avaliando o laser de baixa potência em amostras seminais sugerem que seja utilizado para melhorar os atributos espermáticos e, conseqüentemente, a produção in vitro de embriões. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito do laser de baixa potência sobre a viabilidade espermática e averiguar o efeito desta estimulação na produção in vitro de embriões bovinos. Para isso, amostras comerciais de sêmen criopreservado foram descongeladas e submetidas à irradiação com laser He-NE. No experimento 1 foram testadas as potências de 0; 5; 7,5 e 10mW, por 5 ou 10 minutos de tratamento. As amostras de sêmen foram avaliadas imediatamente após a irradiação e após 30 minutos de incubação. Foram verificadas possíveis interações duplas (Potência*Duração do Tratamento, Potência*Tempo e Duração do Tratamento*Tempo) e tripla (Potência*Duração do Tratamento*Tempo). No experimento 2 foi avaliado o efeito da melhor combinação potência X duração dos tratamentos utilizados no Experimento 1, para irradiar o sêmen utilizado para a produção in vitro de embriões. O laser de baixa potência apresentou efeito sobre diversos atributos relacionados à viabilidade espermática. Este efeito foi dependente da potência e da duração do tratamento. Nas condições experimentais, a potência de 5mW com duração de 10 minutos de aplicação sugere efeitos positivos no aumento na viabilidade espermática. No entanto, o tratamento de espermatozóides nesta potência e duração do tratamento, não apresenta incremento nas taxas de produção nem na qualidade embrionária. / Success of fertilization and the maintenance of subsequent embryo development rely on sperm attributes related to seminal quality. The in vitro production of bovine embryos is an essential tool for genetic gain in the herd. However, its commercial use directly depends on improvement of the production system at a low cost. Inexpensive techniques which provide an increase of seminal quality, allowing the increment of in vitro production of embryos are of great interest to cattle breeding. Low-power laser emits electromagnetic waves with biological effects. These effects are dependent of irradiation parameters and target cell type. Studies with seminal samples irradiated by low potency laser suggest its use to improve several sperm features and, therefore, in vitro production of embryos. This study aimed to evaluate the effect of low potency laser on sperm viability and fertilization ability of irradiated sperm. Briefly, in Experiment 1, samples of frozen/thawed commercial semen were subjected to He-NE laser irradiation. Laser potencies of 0, 5, 7.5 or 10mW were tested for 5 or 10 min of treatment. Samples were evaluated immediately and 30 min after irradiation. Double (Potency*Treatment length, Potency*Time and Treatment length*Time) and triple interactions (Potency*Treatment length*Time) were assessed. Afterwards, in Experiment 2, the effect of the best combination of potency and exposure length on in vitro production of embryos was verified. Low potency laser affected several semen attributes related to sperm viability. This effect was dependent on laser potency and the length of treatment. In the experimental conditions tested in this study, 5mW potency combined to 10 min of exposure had appeared to have positive effect of increasing sperm viability. However, 5mW potency laser for 10 min sperm irradiation did not improve in vitro embryo production rates and bovine embryo quality.

A ineficiência dos protocolos de criopreservação limita o uso em larga escala da produção in vitro de embriões bovinos. O objetivo deste trabalho foi identificar os danos causados pela criopreservação e pelo cultivo embrionário de embriões bovinos produzidos in vitro após a descongelação, avaliando a morfologia, a expressão gênica e o desenvolvimento in vitro antes e após a criopreservação. Complexos cummulusoócitos foram maturados, fecundados e cultivados in vitro. Blastocistos expandidos (n=600) obtidos entre os dias 7 e 9 de cultivo (fecundação D0) foram submetidos a congelação controlada (grupo controlado: 10% de etileno glicol (EG) por 10 minutos, 1,2oC por minuto), congelação rápida (grupo rápido: 10% de EG por 10 minutos , 20% de EG + 20% de Glicerol (Gli) por 30 segundos) ou vitrificação (grupo vitrificação: 10% de EG por 10 minutos, 25% EG + 25% Gli por 30 segundos). Os embriões do grupo controle não foram expostos a crioprotetores e nem a protocolos de criopreservação, sendo avaliado o índice de eclosão 12 dias após a fecundação (46,09%). As palhetas para os protocolos de congelação rápida e vitrificação foram mantidas em vapor de nitrogênio líquido (0,8cm sobre o líquido) por 2 minutos e imersas no nitrogênio líquido. Os embriões foram descongelados por 10 segundos em ar e 20 segundos em banhomaria a 25oC. Os embriões foram reidratados em solução de PBS + 0,2% de BSA + 0,3M de sacarose e em solução de PBS + 0,2% de BSA ambos por 3 minutos. Para avaliar o desenvolvimento, os embriões, após a descongelação, foram co-cultivados com células da granulosa em meio TCM199 ou SOFaa por 4 dias. Os dados foram analisados com o aplicativo PROC MIXED do programa SAS Sistems for Windows®. O grupo controlado apresentou índices de eclosão de 44,65% ± 5,94 e 11,65 ± 3,37 para o meio TCM199 e para o meio SOFaa, respectivamente. Embriões do grupo rápido não apresentaram eclosão, independente do meio de cultivo. O grupo vitrificação apresentou índices de eclosão de 9,43% ± 6,77 e 8,67% ± 4,47, respectivamente, em meio TCM199 e SOFaa. Os valores foram significativos quando p<0,05. O grupo controlado apresentou diferença em relação aos outros grupos em ambos os meios de cultivo. No meio TCM199 os índices de re-expansão e eclosão foram mais altos. Para a análise da expressão gênica, 2 pools de 10 blastocistos expandidos de embriões frescos e criopreservados (congelação controlada) foram utilizados para a extração de RNA. Foi feita reação de Transcrição Reversa (RT-PCR) e de PCR em Tempo Real. Os resultados da reação de PCR em Tempo Real demonstraram que a quantidade de material não foi suficiente para a amplificação de produtos em todas as reações. Concluindo, o meio de cultivo TCM199 exerce influência sobre o desenvolvimento embrionário após a criopreservação, sendo mais apropriado do que o meio SOFaa. E, para proceder a análise da expressão gênica pela reação de PCR em Tempo Real é necessário número maior de blastocistos expandidos. / The inefficiency of embryo cryopreservation protocols limits the broad use of in vitro production (IVP) of bovine embryos. The aim of this work was to identify the damage caused by cryopreservation and embryo culture of in vitro produced bovine embryos after thawing by morphological analysis, gene expression and in vitro development before and after cryopreservation. Cummulus-oocyte complexes were in vitro matured, fertilized and cultured. Expanded blastocysts (n= 600) harvested on days 7-9 were submitted controlled freezing [controlled group: 10% ethylene glycol (EG) for 10 minutes and 1.2oC per minute cryopreservation], quick-freezing [quick group: 10% EG for 10 minutes, 20% EG + 20% Glycerol (Gly) for 30 seconds] or vitrification [vitrification group: 10% EG for 10 minutes, 25% EG + 25% Gly for 30 seconds] protocols. The embryos of the control group were not exposed to cryoprotectant or crypreservation method and the hatching rate was evaluated on day12 post-insemination. The straws (quick and vitrification groups) were first placed on nitrogen vapor (0.8 cm over the liquid nitrogen) for 2 minutes and than immersed in liquid nitrogen. Embryos were thawed in air for 10 seconds followed by 25oC water bath for 20 seconds. Embryos were rehydrated in PBS + 0.2% BSA + 0.3M sucrose for 3 minutes and PBS + 0.2% BSA for the same time. In order to evaluate development of frozen-thawed embryos they were cocultured on granulosa cells in TCM 199 or SOFaa for 4 days. Hatching rate of control group was 46.09%. Data was analyzed by PROC MIXED model of SAS Sistems for Windows®. Controlled group hatching rate was 44.65% ± 5.94 and 11.65% ± 3.37 for TCM 199 and in SOFaa, respectively. Embryos submitted to quick group did not hatch regardless of culture condition. Vitrification group showed hatching rates of 9.43% ± 6.77 and 8.67% ± 4.47, respectively, in TCM 199 and SOFaa., and values were significant at p<0.05. The controlled group showed difference between the other groups of cryopreservation in both medium (TCM 199 and SOFaa). However, TCM 199 showed high rates of re-expansion and hatching. To gene expression analysis, 2 pools of 10 expanded blastocysts of fresh and cryopreserved embryos (controlled freezing) was used to RNA extraction, Reverse Transcription PCR (RT-PCR) was done and submitted to a Real Time PCR. The results of the Real Time PCR showed that the amount of material was not enough to the amplification of products in all reactions. In conclusion, the culture medium influences the embryo development after the cryopreservation being TCM199 more appropriate than SOFaa. And more number of expanded blastocysts is necessary to analysis the gene expression in a Real Time PCR reaction.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-28Bitstream added on 2014-06-13T20:22:50Z : No. of bitstreams: 1 moura_jil_dr_jabo.pdf: 598977 bytes, checksum: d795e7d62685802a19b2e08b52fa6039 (MD5) / Ceplac / Este foi conduzido no sul do estado da Bahia entre os anos de 2004 e 2007. Teve como objetivo determinar a taxa de fecundação de dendezeiros após a introdução de Elaeidobius kamerunicus Faust . Avaliaram-se as relações das espécies E. kamerunicus e Elaeidobius subvittatus Faust através da: flutuação populacional, distribuição espacial, influência de fatores meteorológicos, comportamento com relação às inflorescências das plantas e capacidade de transportar grãos de pólen. A taxa de fecundação nos dendezeiros atingiu 79,4%, representando incremento de 19% quando comparado aos dendezeiros polinizados apenas por E. subvittatus. Plantios comerciais de dendezeiros nos municípios de Taperoá e Nazaré, mostraram taxas de fecundação de 76,8% e 78,0%, respectivamente. E. kamerunicus foi a espécie dominante nos plantios de dendezeiro de Una, BA. Com exceção do município de Itapebi, as populações de E. kamerunicus sobrepujaram as de E. subvittatus em todos os municípios com grandes maciços de dendezeiros subespontâneos. A distribuição das chuvas no sul da Bahia não alterou a atividade polinizadora de E. kamerunicus, permitindo ocorrer taxa constante de fecundação dos frutos. Houve aumento da densidade populacional de E. subvittatus com o incremento térmico no ambiente ocorrendo o oposto com E. kamerunicus. O número de espécimes de E. subvittatus visitando inflorescências femininas de dendezeiros e híbridos interespecíficos foi superior ao de E. kamerunicus entre 6:00 e 8:00 horas, porém E. kamerunicus foi mais numeroso que E. subvittatus entre 9:00 e 12:00 horas. Essas espécies apresentaram pouca atividade polinizadora nas inflorescências femininas entre 14:00 e 16:00 horas, mas E. subvittatus congregou-se nas inflorescências femininas de ambas variedades de plantas a partir de 16:00 horas. Ao anoitecer foi constatada a presença... / The study was conducted in south Bahia between 2004 and 2007 to determine the rate of fertilization of oil palm after the introduction of Elaeidobius kamerunicus Faust in Southern Bahia. Relationships of the species E. kamerunicus and Elaeidobius subvittatus Faust were evaluated through population fluctuation, spatial distribution, influence of meteorological factors, behavior regarding the plant inflorescences and capability to collect and transport pollen grains. The data were analyzed utilizing correlation and variance analysis and test of means. The rate of fertilization in the oil palm trees reached 79.4%, representing an increase of 19% when compared to oil palm trees pollinated only by E. subvittatus. Commercial plantations of oil palm trees in Taperoá and Nazareth municipalities showed rates of fertilization of 76.8% and 78.0%, respectively. E. kamerunicus was the dominant species in the plantations of oil palm trees of Una, BA. With the exception of Itapebi municipality, the populations of E. kamerunicus overwhelmed the E. subvittatus in all municipalities with large plantations of sub-spontaneous oil palm trees. The rainfall distribution in south Bahia did not alter the pollination activity of E. kamerunicus, which permitted a constant rate of fruit fertilization. There was an increase in population density of E. subvittatus with environmental thermal increase, the opposite occurred with E. kamerunicus. The number of specimens of E. subvittatus visiting female inflorescences of oil palm trees and interspecific hybrids was higher than that of E. kamerunicus between 6:00 and 8:00 hours, however E. kamerunicus was more numerous than E. subvittatus between 9:00 and 12:00 hours. These species presented little pollination activity in female inflorescences between 14:00 and 16:00 hours, but E. subvittatus congregated in the female inflorescences of both oil palm varieties starting ...(Complete abstract click electronic access below)

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-22T14:30:07Z No. of bitstreams: 1 elizetedossantosealhadas.pdf: 845190 bytes, checksum: 27880d4df7dd569177866e95bbcf325b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T14:08:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 elizetedossantosealhadas.pdf: 845190 bytes, checksum: 27880d4df7dd569177866e95bbcf325b (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T14:08:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 elizetedossantosealhadas.pdf: 845190 bytes, checksum: 27880d4df7dd569177866e95bbcf325b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T14:08:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 elizetedossantosealhadas.pdf: 845190 bytes, checksum: 27880d4df7dd569177866e95bbcf325b (MD5) Previous issue date: 2014-02-28 / Leptinaria unilamellata, espécie de molusco pulmonado terrestre, é hermafrodita simultâneo, e se reproduz tanto por autofecundação quanto por fecundação cruzada. Os objetivos deste estudo foram: (1) investigar e comparar aspectos da história de vida de indivíduos da espécie L. unilamellata gerados por autofecundação e fecundação cruzada e mantidos isolados ou pareados, e, (2) comparar aspectos reprodutivos e desenvolvimento corporal de moluscos da espécie L. unilamellata mantidos isolados, pareados e pareados impedidos de fecundação cruzada, para se verificar o quanto a presença do coespecífico influencia aspectos da história de vida. Para o primeiro experimento, de criações matrizes, foram obtidos 30 moluscos recém-eclodidos que foram mantidos isolados até gerarem filhotes por autofecundação. Os filhotes recém-eclodidos foram separados em dois grupos experimentais: trinta indivíduos isolados e trinta pareados. Dois grupos-controle foram formados com indivíduos recém-eclodidos, gerados por fecundação cruzada, mantidos isolados e pareados. Para o segundo experimento, trinta moluscos foram criados aos pares, porém, com uma tela dividindo o terrário para impedir cruzamento. Como grupos-controle foram utilizados 30 moluscos isolados e 30 pareados. Foram observados os seguintes parâmetros em ambos os experimentos: crescimento, taxa reprodutiva, mortalidade, tempo para o alcance da maturidade sexual, fecundidade, número total de filhotes produzidos, número de eventos reprodutivos e intervalo entre eventos reprodutivos. No primeiro experimento, desde o alcance da maturidade sexual, até o final do experimento, os moluscos mantidos pareados oriundos de fecundação cruzada apresentaram menor comprimento e massa corporal do que os moluscos pareados oriundos de autofecundação, isolados oriundos de fecundação cruzada e isolados provenientes de autofecundação. Os moluscos mantidos pareados oriundos de fecundação cruzada também apresentaram menor taxa de crescimento antes da maturidade sexual quando comparados aos moluscos isolados oriundos de fecundação cruzada e os moluscos isolados e pareados gerados por autofecundação. Os moluscos isolados gerados por autofecundação, mantidos tanto isolados como pareados produziram, em média, mais filhotes que os moluscos provenientes de fecundação cruzada. No segundo experimento, foi observado que, em alguns aspectos, os moluscos pareados impedidos de encontro com o coespecífico, não foram significativamente diferentes dos moluscos mantidos pareados, como, por exemplo, o tempo para alcance da maturidade sexual e crescimento até essa idade. No entanto, eles se assemelharam aos moluscos mantidos isolados em relação ao número de eventos reprodutivos. / Leptinaria unilamellata is a species of hermaphroditic terrestrial pulmonate mollusc. This species reproduces both by selfing and by outcrossing. The aim of this study was to investigate and to compare aspects of the life history of L. unilamellata generated by selfing and outcrossing and keeping isolated or in pairs. For this, 30 newly hatched snails were kept isolated to generate offspring by selfing. The newly hatched snails were divided into two experimental groups: 30 individuals were kept in pairs and 30 individuals were kept isolated. Thirty newly hatched snails were kept in pairs to generate offspring by outcrossing. The newly hatched snails were divided into two experimental groups: 30 individuals were kept in pairs and 30 individuals were kept isolated. The following parameters were observed: growth, reproductive rate, mortality, time to reach sexual maturity, fecundity, total number of offspring produced, number of reproductive events and interval between reproductive events. Since the reach sexual maturity until the end of the experiment, the snails kept in pairs generated by outcrossing showed lower length and weight when compared to other treatments. This group also showed lower growth rate prior to sexual maturity when compared to the others. Isolated snails generated by selfing produced, on average, more offspring than those generated by outcrossing. It has been found that the presence of conspecific in this species can lead to an effort allocation for reproduction at the expense of growth, which could explain the reduced growth of individuals kept in pairs generated by outcrossing.