Submitted by Tatiana Silva (tsilva@icict.fiocruz.br) on 2012-12-26T17:13:19Z No. of bitstreams: 1 grazielle_a_ribeiro_ioc_bcm_0041_2011.pdf: 6422583 bytes, checksum: 60938d27c3503eecb3ae677f9a14c36e (MD5) / Made available in DSpace on 2012-12-26T17:13:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 grazielle_a_ribeiro_ioc_bcm_0041_2011.pdf: 6422583 bytes, checksum: 60938d27c3503eecb3ae677f9a14c36e (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / As leishmanioses constituem um conjunto de doenças negligenciadas que afetam cerca de 12 milhões de indivíduos em mais de 80 países. Os medicamentos utilizados no controle da infecção estão associados à baixa eficácia, alta toxicidade, dificuldade de administração, altos custos e crescente resistência. Na busca por agentes mais eficazes, uma série de naftopterocarpanoquinonas foram projetadas e sintetizadas, das quais a LQB-118 mostrou-se a mais ativa. Esse trabalho teve como objetivo avaliar os possíveis mecanismos de ação da LQB-118 sobre Leishmania amazonensis, identificando as organelas alvo e o tipo de morte desencadeado no parasito. Alterações morfológicas foram avaliadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Os resultados de MEV mostraram que a LQB-118 induziu retração celular e arredondamento nas promastigotas tratadas, que tornaram-se significativamente menores. Os resultados de MET mostraram que promastigotas tratadas com 2,5μM de LQB-118 apresentaram desestruturação no complexo de Golgi e número aumentado de vacúolos no citoplasma. Promastigotas incubadas com 10μM de LQB-118 apresentaram-se com citoplasma rarefeito, compactação da cromatina, mitocôndria com matriz elétron-densa e cristas dilatadas, e protuberâncias na membrana plasmática (blebs). Ensaios realizados por citometria de fluxo mostraram que o tratamento com 5μM de LQB-118 induziu exposição de fosfatidilserina indicativa de apoptose em 30% dos parasitos. A LQB-118 induziu a perda do potencial de membrana mitocondrial (m) em 70% dos parasitos avaliados por marcação com rodamina em citometria. Essa perda do m foi confirmada por fluorimetria e mostrou ser concentração-dependente quando as promastigotas foram tratadas com 2,5, 5 e 10μM de LQB-118. O tratamento das promastigotas com 2,5, 5 e 10M de LQB-118 por 48 horas induziu fragmentação no DNA de 37%, 67% e 81% da células, respectivamente, conforme avaliado pela técnica de TUNEL. Macrófagos tratados com LQB-118 não apresentaram exposição de fosfatidilserina, perda do m, e fragmentação de DNA, mostrando que o composto age de maneira setiva sobre os parasitos. Análises realizadas por microscopia de fluorescência indicaram que esse agente também induziu fragmentação do DNA de amastigotas intracelulares de L. amazonensis, sem provocar fragmentação do DNA da célula hospedeira. Dessa forma, a LQB-118 parece provocar de maneira seletiva em L. amazonensis muitas das alterações associadas ao processo de apoptose clássico. O colapso do potencial mitocondrial do parasita pode ser um mecanismo plausível para a atividade leishmanicida da LQB-118, a partir do qual o processo de morte celular programada seria disparado. / Leishmaniasis is a complex of neglected diseases that affect approximately 12 million people in over 80 countries. The drugs used in the treatment of the infection are associated with low efficacy, high toxicity, difficult administration, high costs and increasing resistance. In the search for more effective agents, a series of naphthopterocarpanquinones were designed and synthesized, of which LQB-118 was the most active. This study aimed to evaluate the possible mechanisms of action of LQB-118 on Leishmania amazonensis, identifying the target organelles and the type of death triggered on the parasite. Morphological changes were evaluated by both scanning (SEM) and transmission (TEM) electron microscopy. SEM showed a clear parasite retraction and rounding, with a significant reduction in size. TEM revealed Golgi complex disruption and increased number of vacuoles in the cytoplasm of promastigotes treated with 2.5μM LQB118. Promastigotes incubated with 10μM LQB-118 had scarce cytoplasm, chromatin condensation, mitochondria with electron dense matrix and disrupted cristae, and blebs on the plasm membrane. Assays by flow cytometry showed that the treatment with 5μM LQB-118 induced phosphatidylserine exposure indicative of apoptosis in about 30% of parasites. The LQB-118 induced loss of m in 70% of the parasites stained with rhodamine as evaluated using cytometry. This loss of m was confirmed by fluorimetry and showed to be dose dependent when the promastigotes were treated with 2,5, 5 and 10 M LQB-118. Treatment of promastigotes with 2,5, 5 and 10M LQB-118 for 48 hours induced DNA fragmentation in 37%, 67% and 81% of cells, respectively, as evaluated by TUNEL assay. Macrophages treated with LQB-118 did not present phosphatidilserine exposure, loss in the m and DNA fragmentation, indicating that this compound acts selectively on the parasite. Analyses performed by fluorescence microscopy indicated that this compound also induced DNA fragmentation in intracellular amastigotes of L. amazonensis, but failed to induce DNA fragmentation in the host cells. Thus, LQB-118 is able to trigger in L. amazonensis promastigotes several changes associated with classical apoptosis. The collapse of mitochondrial potential of the parasite may be a plausible mechanism for the leishmanicidal activity of LQB-118, triggering the process of programmed cell death.

Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-15T14:39:51Z No. of bitstreams: 2 dissertação JEYCE KELLE.pdf: 1297553 bytes, checksum: 4146e619dc069490804cd394359499a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-15T14:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertação JEYCE KELLE.pdf: 1297553 bytes, checksum: 4146e619dc069490804cd394359499a2 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CAPES / Atualmente o câncer é considerado uma doença genética, pois durante seu desenvolvimento as células passam por diversas instabilidades genômicas sendo considerada a segunda causa de morte no mundo. A nitrofurantoína é um derivado nitrofurano hindantoínico amplamente utilizado no tratamento de infecções do trato urinário, cujo mecanismo de ação ainda não está muito bem definido. Neste trabalho foram realizados testes citotóxicos da nitrofurantoína e quatro novos derivados n-alquilados em linhagens de células cancerígenas. O ensaio de citotoxicidade foi feito através do teste do MTT (brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium) e as ferramentas utilizadas para avaliação do mecanismo de ação incluíram o teste de exclusão do azul de tripan, análise morfologia por coloração May-Grunwald-Giemsa, microscopia de fluorescência através da marcação com anexina V\Iodeto de propídeo, análise da fragmentação do DNA pelo teste do DNA Ladder e análise da expressão de genes anti-apoptótico BCLxL e pró-apoptótico Bax. Os resultados mostraram que a nitrofurantoína e todos os derivados testados apresentaram atividade citotóxica frente a quatro linhagens de células tumorais MCF-7 (Adenocarcinoma de mama), NCI-H292 (carcinoma mucoepidermoide de pulmão), HT-29(Adenocarcinoma de colon) e HL-60 (Leucemia promielocítica). O derivado N-pentil nitrofurantoina (M8A) foi o composto selecionado e a linhagem HL-60 foi escolhida para os estudos de avaliação do mecanismo de ação. No teste do azul de tripan o M8A diminuiu a viabilidade celular nas duas concentrações testadas (6,0 e 12,0 μg\mL). A análise morfológica indicou que o M8A induziu as células à apoptose, pois os núcleos apresentaram condensação da cromatina, fragmentação do DNA e picnose. A análise de fragmentação do DNA mostrou que as células sofreram apoptose no padrão de 180-200 pares de bases. O teste de microscopia de fluorescência confirmou os resultados do DNA ladder, mostrando que o derivado está induzindo as células a sofrem apoptose pela externalização da fosfatidilserina marcadas com anexina V nas duas concentrações testadas. Na análise de RT-PCR pôde-se verificar o aumento da expressão da proteína pró-apoptótica Bax, confirmando assim o processo de apoptose e indicando o envolvimento da via intrínseca. Os resultados mostram que o derivado M8A é um agente anticâncer promissor e esses dados são inéditos para esta classe de moléculas.

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

Introdução: Doze a 29 % dos ejaculados tem viscosidade seminal aumentada. Uma das técnicas recomendadas para diminuir a viscosidade do sêmen consiste num processo físico em que se passa o sêmen, 4 vezes, por uma seringa de 10 mL com agulha 18G. Ao fim desse processo, ter-se-ia modificado o comportamento molecular das fibrilas protéicas do esperma, tornando-o mais liquefeito, sem dano aparente a morfologia ou motilidade dos espermatozoides. Atualmente, discute-se sobre a total inocuidade desta técnica, uma vez que ela poderia provocar aumento da fragmentação do DNA dos espermatozoides. A hiperviscosidade seminal, além de reduzir a concentração e a motilidade dos espermatozoides, pode afetar a capacitação e a reação acrossômica, podendo ter implicações na integridade do DNA e no desenvolvimento embrionário normal. Objetivo: Comparar a fragmentação do DNA de espermatozoides humanos em amostras com viscosidade diminuída, fisiológica e aumentada, e avaliar se o processo de expulsão do sêmen através da agulha e seringa altera significativamente as taxas de fragmentação do DNA dos espermatozoides. Método: Após a coleta e avaliação dos parâmetros seminais das amostras de sêmen, aquelas que estiverem com viscosidade aumentada passarão pelo processo de expulsão através da seringa de 10 mL com agulha 18G por 4 vezes, para diminuir a viscosidade seminal. Posteriormente, serão feitas análises da fragmentação do DNA dos espermatozoides através da técnica de TUNEL em todas as amostras. Resultados: A fragmentação do DNA entre amostras com viscosidade fisiológica, diminuída e aumentada não apresentou diferença estatisticamente significativa (P=0,857). A fragmentação do DNA aumentou significativamente (P=0,035) nas amostras com viscosidade aumentada após passar na seringa e agulha quando comparadas com as mesmas amostras antes de passar pela mesma. Conclusão: O processo de expulsão do sêmen através de seringa e agulha visando redução da viscosidade seminal aumenta a fragmentação do DNA no espermatozoide, devendo este processo ser substituído por um processo inócuo. / Background: Twelve to 29 % of the ejaculated have the semen viscosity increased. One of the techniques recommended to decrease the viscosity of semen is a physical process in which the semen passes four times through a 10mL syringe with a 18G needle. At the end of this process would have modified the molecular behavior of the protein fibrils of the sperm making it more liquefied, without apparent damage to the morphology or motility of spermatozoa. Currently, the debate is about the complete safety of this technique since it could result in increased DNA fragmentation of spermatozoa. The seminal viscosity moreover reduces the concentration and motility of sperm, can affect the capacitation and acrosome reaction which may have implications for DNA integrity and normal embryonic development. Objective: To compare the DNA fragmentation in human semen samples with reduced, physiological and increased viscosity and evaluate if the process of expulsion of semen through the needle and syringe significantly alter rates of sperm DNA fragmentation. Methods: After collecting and evaluating semen parameters of semen samples, those that are with increased viscosity will pass through the process of expulsion through the 10 mL syringe with a 18G needle four times to reduce the viscosity of semen. After that, analysis of spermatozoa DNA fragmentation through the TUNEL technique will be made in all samples. Results: The fragmentation of DNA between samples with physiological, reduced and increased viscosity is not statistically significant (P=0.857). The DNA fragmentation increased significantly (P=0.035) in samples with increased viscosity after passing the syringe and needle when compared with the same samples before going through the same. Conclusion: The process of expulsion of semen through a syringe and needle in order to reduce the semen viscosity increases the DNA fragmentation in sperm, and this shall be replaced by a harmless process.

A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30ο dia do ciclo espermático comparado a 7ο dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes' activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

O Ácido Indol Acético (AIA) é um hormônio, denominado auxina e há uma correlação direta entre o efeito citotóxico do AIA e da atividade da peroxidase nas células animais. Os Neutrófilos apresentam uma alta atividade de peroxidase e o AIA gera uma mudança ultra-estrutural e morte destas células em cultura. Entretanto, estudos in vivo mostram que a administração de AIA em baixas doses não promove um efeito prooxidante em neutrófilos e esta suplementação aumenta o englobamento de partículas de Zymosan por estas células. No presente estudo foram avaliados os efeitos da administração do AIA na capacidade fagocitária e na integridade celular de neutrófilos de ratos, observando os seguintes parâmetros: i) capacidade fagocitária – englobamento e morte de Staphylococcus aureus; ii) integridade celular – integridade da membrana plasmática, fragmentação de DNA e potencial transmembrana mitocondrial e iii) atividade de mieloperoxidase. O tratamento aplicado com AIA não apresentou alteração significante na capacidade de englobamento e morte de S. aureus pelos neutrófilos quando aos controles. A integridade celular e atividade de mieloperoxidase nos neutrófilos não foram alteradas pela suplementação com AIA comparadas aos controles. A administração de AIA em baixas doses não mostrou efeito na morte de S. aureus pelos neutrófilos o mesmo também não alterou a integridade celular e a atividade da mieloperoxidase destas células. / Indole acetic acid is (IAA) a hormone termed auxins and there is a direct correlation between the cytotoxic effect of IAA and the peroxidase activity of the animal cells. Neutrophils present a higher peroxidase activity and the IAA leads to marked ultra structural changes and death on these cells in culture. However studies in vivo show that IAA administration at low doses does not promoting a prooxidant effect on neutrophil and this supplementation to increase of the engulfment of Zymosan particles by these cells. In present study were evaluated the effect of IAA administration in the phagocytic capacity and cellular integrity on rat’s neutrophils from the following parameters: i) phagocytic capacity – engulfment and killing of the Staphylococcus aureus; ii) cellular integrity – plasma membrane integrity, DNA fragmentation and mitochondrial transmembrane potential and iii) myeloperoxidase activity. The IAA treatment imposed did not show another significant alteration in the S. aureus engulfment and killing capacity by neutrophils to compare with controls. The cellular integrity and myeloperoxidase activity in the neutrophils did not have alteration by IAA supplementation to compare with the controls. In conclusion the IAA administration at low doses did not show effective action in S. aureus killing by neutrophils and the same time as did not alter the cellular integrity and myeloperoxidase activity by this cell.

A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, sendo que alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos, sendo que os mais importantes são a apoptose, a deficiência de protamina e os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Os danos de DNA espermático não impedem que o espermatozóide fecunde o oócito, entretanto podem causar perda embrionária por apoptose. A importância da integridade da cromatina espermática no desenvolvimento embrionário já foi descrita em humanos, sendo que pode ser atribuída como uma das causas de infertilidade masculina, quando está alterada. Contudo, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e do desenvolvimento embrionário na espécie bovina são muito escassas. Devido à falta de informação sobre a relação da fragmentação de DNA e conseqüente alteração nos índices de desenvolvimento embrionário nessa espécie, este trabalho teve como objetivo avaliar o índice de fragmentação de DNA espermático em uma população de touros e verificar a influência dos possíveis danos de DNA espermático na produção in vitro (PIV) de embriões. Para isto, o sêmen congelado de 221 touros foi avaliado pelo ensaio de estrutura de cromatina espermática (SCSA). Após o ensaio, os animais foram divididos em seis grupos experimentais de acordo com o índice de fragmentação de DNA apresentado, sendo sete animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente para as avaliações espermáticas: motilidade, fragmentação de DNA espermático pelos ensaios SCSA e Cometa Alcalino e estresse oxidativo pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Posteriormente foi realizada a PIV de embriões, sendo avaliados os índices de clivagem e de blastocisto e realizado o ensaio de TUNEL para a avaliação da apoptose dos blastocistos produzidos. Em relação à motilidade espermática, o grupo 1 apresentou menor motilidade em relação ao grupo 4 (p<0,05). Não foi verificada diferença significativa da motilidade entre os outros grupos experimentais. O ensaio SCSA revelou que o grupo 1 apresentou menor susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático quando comparado com o grupo 5 (p< 0,05). O grupo 2 apresentou susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático inferior, quando comparado aos grupos 3, 4, 5 e 6 (p<0,05). Em relação ao ensaio Cometa Alcalino, a avaliação do estresse oxidativo e a PIV de embriões, não houve diferença significativa entre os grupos experimentais. Além disso, foi observada correlação negativa entre a intensidade média do Cometa e o índice de blastocisto produzido in vitro. O índice de blastocisto também apresentou correlação negativa com a intensidade média da cabeça do Cometa e ao ensaio TBARS. O ensaio TBARS apresentou correlação negativa com o índice de clivagem dos embriões PIV. Por outro lado, o ensaio TBARS apresentou correlação positiva com os ensaios SCSA e TUNEL. Considerando as condições experimentais, a fragmentação de DNA espermático não influenciou a PIV de embriões bovinos. / Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur for several reasons, and the most important are apoptosis, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS). The sperm DNA damage does not prevent the sperm to fertilize the oocyte, however it can cause embryonic loss by apoptosis. The importance of sperm chromatin integrity in embryonic development has been described in humans, and can be considered a cause of male infertility when it is disrupted. However, information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are very scarce. Due to the lack of information on the relationship between DNA fragmentation and its consequence on embryonic development rates in this species, this study aimed to evaluate the sperm DNA fragmentation rate in a population of bulls and the influence of possible sperm DNA damage on in vitro production (IVP). For this, frozen semen from 221 bulls was evaluated by sperm chromatin structure assay (SCSA). After that, animals were divided into six groups, according to the DNA fragmentation rate observed. Then seven animals from each group were randomly chosen for sperm evaluation: motility, sperm DNA fragmentation by the SCSA and Alkaline Comet assay and oxidative stress by tiobarbituric acid reactive substances (TBARS). After sperm evaluations embryo IVP was performed. Cleavage and blastocyst rates were assessed and the obtained blastocysts were submitted to TUNEL assay for apoptosis evaluation. Regarding sperm motility, group 1 had lower motility compared to group 4 (p <0.05). There was no significant difference in motility between the other experimental groups. The SCSA revealed that group 1 showed lower susceptibility to sperm DNA fragmentation when compared to group 5 (p <0.05). Group 2 was less susceptible to sperm DNA fragmentation, when compared to groups 3, 4, 5 and 6 (p <0.05). For the alkaline comet assay, the assessment of oxidative stress and embryo IVP, no significant difference was shown between en experimental groups. Moreover, there was a negative correlation between the comet mean intensity and the blastocyst rate. The blastocyst rate also negatively correlated to the comet head mean intensity and TBARS. The TBARS was negatively correlated to cleavage rate. In addition, TBARS correlated positively to TUNEL assay and SCSA. Considering the experimental conditions, the sperm DNA fragmentation did not influence the IVP of bovine embryos.

A fragmentação do DNA espermático é uma das principais causas de infertilidade nos machos. Alterações na integridade do DNA podem ser decorrentes da ação de espécies reativas de oxigênio (EROS), de defeitos na protaminação e da apoptose. A sensibilidade do espermatozoide ovino frente as biotecnologias reprodutivas pode ser resultado de uma alta suscetibilidade a ação de EROS ou alterações na protaminação espermática desencadeadas por estresse oxidativo induzido por estresse térmico, tornando o espermatozoide mais suscetível a fragmentação de DNA. Com o objetivo de entender mais este processo, foi realizado um primeiro experimento para avaliar o status oxidativo, os atributos espermáticos e a expressão gênica de proteínas envolvidas nos processos de protaminação em diferentes níveis de suscetibilidade a peroxidação lipídica (baixo, médio, alto e altíssimo) em sêmen ovino. Foi observado um aumento da atividade enzimática da glutationa peroxidase e uma diminuição da atividade enzimática da glutationa redutase no plasma seminal no grupo com suscetibilidade a peroxidação lipídica alta e altíssima. Com relação a catalase, não foi verificado esse aumento, no entanto houve maior imunodetecção desta enzima. Em relação a condição espermática, observou-se um aumento na porcentagem de defeitos totais e lesões nas membranas acrossomal e plasmática, além de porcentagens menores de espermatozoides com baixo potencial de membrana mitocondrial no grupo com maior suscetibilidade a peroxidação lipídica. Este mesmo grupo também apresentou alta suscetibilidade ao dano da cromatina e aumento do número de cópias do gene da protamina 1 (PRM1) em espermatozoides. O segundo experimento avaliou os atributos de espermatozoides provenientes do ejaculado e do epidídimo frente ao estresse térmico induzido por insulação testicular (tratado), assim como as relações com o status antioxidante. Observou-se diminuição da motilidade, vigor, turbilhonamento e aumento na porcentagem de defeitos maiores e menores, e de lesões na membrana acrossomal e plasmática em espermatozoides ejaculados no grupo tratado. Essas diferenças não foram observadas em espermatozoides epididimais. Uma maior atividade enzimática da glutationa peroxidase e da glutationa redutase foi observada no plasma seminal do grupo tratado. Foi verificado uma diminuição de espermatozoides com alto potencial de membrana mitocondrial no grupo tratado, indicando que o metabolismo mitocondrial parece estar envolvido no quadro de estresse oxidativo. Um terceiro estudo foi conduzido para verificar o efeito do estresse térmico na integridade da cromatina espermática, na protaminação do DNA espermático e na ativação de vias apoptóticas em testículo ovino. Em espermatozoides provenientes do ejaculado, houve um aumento da porcentagem de células com suscetibilidade a fragmentação da cromatina no grupo tratado; não observado em espermatozoides epididimais. Uma alta porcentagem de espermatozoides com fragmentação de DNA grau III (ensaio COMETA) e aumento do número de cópias de mRNA da proteína de transição 1 (TNP1) em espermatozoides provenientes do ejaculado, foi observada no grupo tratado. Já em espermatozoides provenientes do epidídimo, a PRM1 apresentou maior expressão no 30&omicron; dia do ciclo espermático comparado a 7&omicron; dia, enquanto que a TNP1 comportou-se de maneira contrária. Em relação a ativação de vias apoptóticas em testículo ovino, a proteína anti-apoptótica Bax foi imuno-identificada em espermatócitos e a Blc-2 em espermátides, sem diferença entre os grupos. Em conclusão, a alta susceptibidade dos espermatozoides ovinos a peroxidação lipídica altera o status oxidativo ocasionando um quadro de estresse oxidativo, principal causador de dano a cromatina. Adicionalmente, o estresse oxidativo induzido por estresse térmico prejudica os atributos espermáticos e aumenta a suscetibilidade dos espermatozoides a fragmentação de DNA. / Sperm DNA fragmentation is referred as one of the main causes of male\'s infertility. Among the etiologies of abnormalities on DNA integrity the action of reactive oxygen species (ROS), protamination failures and apoptosis are considered the most important. The known sensitivity of ram´s sperm to reproductive biotechnologies could be a result of a higher susceptibility to the action of ROS or changes in sperm protamination triggered by oxidative stress induced by heat stress. This would increase the susceptibility of sperm DNA to fragmentation. Initially, the ram sperm quality, seminal protamine gene expression and oxidative status were evaluated in semen samples of different levels of susceptibility to lipid peroxidation (low, medium, high and very high). There was an increase on glutathione peroxidase and decreased glutathione reductase enzymes&#39; activity in groups with high and very high susceptibility to lipid peroxidation. However, only catalase showed increased immunodetection. An increase on total defects and damaged acrosomal and plasmatic membranes were observed in the group showing the highest susceptibility to lipid peroxidation. Also, the percentage of sperm with low mitochondrial membrane potential, the percentage of sperm susceptible to chromatin damage and the number of copies of protamine 1 (PRM1) mRNA were increased in the group showing higher susceptibility to lipid peroxidation. The second study evaluated sperm\'s attributes from the epididymis and ejaculated sperm subjected to heat stress induced by testicular insulation (treated group), as well as correlations with the antioxidant status. We observed decrease on motility, vigor, and mass motility and increase on the percentages of sperm showing major and minor defects, and damaged plasma and acrosome membranes in the treated group. These differences were not observed in epididymal sperm. Increased enzymatic activities of glutathione peroxidase and glutathione reductase were observed in the treated group. Mitochondrial metabolism appeared to be involved in the oxidative homeostasis imbalance. This was effectively observed by a decrease on the percentage of sperm with high mitochondrial membrane potential in the treated group. A third study was conducted to determine the effect of heat stress induced by testicular insulation on the integrity of chromatin, protamination and apoptotic activation pathway in ram testis. An increase on the percentage of sperm with susceptibility to chromatin fragmentation in the treated group was observed. However, the previous findings were not observed in epididymal sperm. A higher percentage of sperm showing DNA fragmentation level III (Comet assay) and an increase on the number of copies of transition protein 1(TNP1) mRNA were observed in the treated group. In epididymal sperm, a higher expression of the PMR1 gene was observed on the 30th day of the espermatogenic cycle, while TNP1 behaved contrarily. In the testicular samples, the anti-apoptotic protein Bax was detected only in spermatocytes while Bcl-2 was observed singularly in spermatids, with no difference between groups. In conclusion, the disruption of oxidative homeostasis may be exacerbated by the higher susceptibility of ram\'s sperm to lipid peroxidation, which could be the main etiology of chromatin damage. In addition, oxidative stress induced by heat stress impairs sperm attributes and DNA integrity.

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A citotoxicidade do extrato etanólico e frações foi avaliada através do ensaio de viabilidade celular com o MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]). A concentração citotóxica 50% (CI50) foi determinada por regressão linear. O extrato, frações e subfrações foram submetidas a análise em cromatografia em camada delgada (CCD), e reunidas de acordo com características semelhantes. Frações do extrato com CI50 ≤ 30 μg/mL e substância isolada com CI50 ≤ 4 μg/mL são considerados citotóxicos. As frações que apresentaram citotoxicidade moderada a baixa foram submetidas aos ensaios de indução de apoptose e fragmentação de DNA por citometria de fluxo. Também, estas amostras foram submetidas a avaliação de estresse oxidativo pelo método TEAC e DPPH. O extrato de A. glabra (rendimento de 8,39%) foi particionado obtendo-se a fração metanólica (rendimento de 88,14%) e fração hexânica (rendimento de 8,08%). O extrato etanólico, sua fração metanólica e rutina apresentaram baixa citotoxicidade (CI50=137,7; 139,4; > 200 μg/mL, respectivamente). Fração hexânica e subfrações 17 e 19 apresentaram citotoxicidade moderada não significativa (CI50= 45,07; 53,45; 80,65 μg/mL, respectivamente). Todas as amostras avaliadas não induziram células a apoptose, entretanto, extrato etanólico, fração hexânica e rutina promoveram alterações na morfologia das células. Entretanto, fração hexânica, subfrações 6 e 7 apresentaram capacidade de fragmentar DNA das células. O fracionamento do extrato etanólico favoreceu o potencial citotóxico, tendo a fração hexânica como a mais promissora, e a capacidade antioxidantes também foi favorecida tendo o grupo 5 como o mais promissor. Estes resultados sugerem que as amostras de A. glabra apresentam baixo potencial citotóxico, e o mecanismo envolvido não está relacionado a indução de apoptose, e o extrato etanólico contém substâncias com capacidade antioxidante. / The present study evaluated the cytotoxic and cytoprotective potential of ethanolic extract obtained from the shells of Annona glabra, its fractions and isolated substances. The powder obtained from A.glabra husks was subjected to maceration with ethanol for 7 days, and the solution was concentrated in a rotavaporator to residue. The ethanolic extract from A.glabra was partitioned between aqueous hexane: methanol (9: 1). The methanolic fraction was fractionated in chromatographic column using as Sephadex stationary phase and mobile phase the methanol. The cytotoxicity of the ethanolic extract and fractions was evaluated by the MTT cell viability assay ([3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide]). The extract, fractions and subfractions were submitted to thin layer chromatography (CCD) analysis, and pooled according to similar characteristics. The 50% cytotoxic concentration (IC 50) was determined by linear regression. Fractions of the extract with IC50 ≤ 30 μg / mL and isolated substance with IC50 ≤ 4 μg / mL are considered cytotoxic. Fractions with moderate to low cytotoxicity were submitted to the induction of apoptosis and DNA fragmentation by flow cytometry. Also, these samples were submitted to evaluation of oxidative stress by the TEAC and DPPH method. The extract of A. glabra (8.39% yield) was partitioned to give the methanolic fraction (yield 88.14%) and hexane fraction (yield 8.08%). Ethanolic extract, methanolic fraction and rutin showed low cytotoxicity (IC50 = 137.7, 139.4,> 200 μg / mL, respectively). Hexanic fraction and subfractions 17 and 19 showed moderate non-significant cytotoxicity (IC50 = 45.07, 53.45, 80.65 μg / mL, respectively). All the evaluated samples did not induce apoptosis cells, however, ethanolic extract, hexane fraction and rutin promoted changes in the cell morphology. However, hexanic fraction, subfractions 6 and 7 showed the ability to fragment DNA from cells. The fractionation of the ethanolic extract favored the cytotoxic potential, with the hexane fraction being the most promising, and the antioxidant capacity was also favored, with group 5 being the most promising. These results suggest that A. glabra samples have low cytotoxic potential, and the mechanism involved is not related to the induction of apoptosis, and the ethanolic extract contains substances with antioxidant capacity.