O ácido indol-3-acético (AIA) é uma auxina natural, metabólito do triptofano, e é produzido em células animal, vegetal e em alguns microrganismos podendo atuar como antioxidante. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar o poder antioxidante do AIA, frente a um estresse oxidativo hepático induzido pelo hepatocarcinógeno dietilnitrosoamina (DEN). Foram utilizados camundongos BALB/c com dois meses. Em uma primeira etapa do estudo foram utilizados machos e fêmeas com o propósito de se avaliar somente o efeito do AIA administrado diariamente por 15 dias nas doses de 100, 200 e 500 mg/Kg de peso vivo. Em uma segunda etapa foram utilizados somente machos submetidos ao AIA (50, 250 e 500 mg/Kg de peso vivo) por 15 dias e no 16o dia foram expostos ao DEN por 4 h ou por 24 h. Foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) evolução do peso e porcentagem relativa do fígado; 2) alterações metabólicas hepáticas avaliadas pelas atividades de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) no soro; 3) perfil oxidativo hepático nas atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) e dos níveis de glutationa reduzida e glutationa oxidada e 4) fragmentação de DNA hepático. Os resultados foram analisados pela análise de variância (ANOVA) com significância de 0,05 usando o teste de Tukey.O AIA não demonstrou efeito tóxico nas doses utilizadas tanto para machos quanto para fêmeas em nenhum dos parâmetros analisados, pois esses parâmetros não apresentaram diferença significativa em relação aos controles (apenas tampão fosfato salina, pH 7,4). A exposição dos animais ao DEN por 4 h demonstrou diminuição na atividade da CAT e GR em 30% e 23%, respectivamente em relação ao controle. O DEN induziu fragmentação de DNA, somente após 24 horas, correspondentes a 210, 410 e 610 pares de bases (pb). A atividade da CAT e GR nos animais que receberam AIA e expostos ao DEN por 4 h não apresentaram alteração significativa em relação aos controles. Porém, a administração de AIA protegeu, apenas parcialmente o DNA dos efeitos defragmentação causados pela exposição ao DEN por 24 horas, pois se observou uma redução dessa fragmentação em 42%, 51% e 48% para os fragmentos de 210 pb, em 54%, 56% e 55% para os fragmentos de 410 pb e em 51%, 57% e 53% para os fragmentos de 610 pb nos animais que receberam AIA nas respectivas doses de 50, 250 e 500 mg/Kg de peso vivo, em relação aos controles. Concluiu-se que o AIA nas doses administradas, não alterou a evolução do peso, massa relativa do fígado, atividade de ALT e AST e perfil oxidativo hepático dos animais, sugerindo que esta auxina, não é tóxica; e que o AIA promoveu a proteção do fígado dos animais frente aos efeitos deletérios causados pelo DEN, baseado na atividade das enzimas CAT e GR e fragmentação de DNA, demonstrando um efeito antioxidante dessa auxina. / The indol-3-acetic acid (IAA) is a natural auxin, metabolite of the tryptophane, is produced in animal cells, vegetable and in some microorganisms being to act like antioxidant. The objective of the present study was to evaluate the antioxidant effect of the IAA, facing a liver oxidative stress induced by the hepatocarcinogenic diethylnitrosoamine (DEN). Were utilized mice BALB/c with 2 months. In a first phase of the study were utilized males and females with the purpose of to evaluate only the effect of the IAA administered daily by 15 days in the doses of 100, 200 and 500 mg/Kg of body weight. In a second phase were utilized only males submitted to IAA (50, 250 and 500 mg/Kg of body weight) daily during 15 days and in the 16ht day the animals were exposed to the DEN for 4 h or for 24 h. They were evaluated the following parameters: 1) evolution of the weight of the animals and the relative percentage of the liver; 2) liver metabolic alterations evaluated by the activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in the serum; 3) liver oxidative stress available by antioxidant enzyme activity as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) and by levels of the oxidized glutathione and reduced glutathione and 4) fragmentation of liver DNA. The results were analyzed by the analysis of variance (ANOVA) with significance at 0.05 using Tukey test. The IAA did not showed toxic effect in the doses utilized for both males and females for all analyzed parameters, those parameters did not shown significant difference to compare with the controls (only phosphate buffer saline, pH 7.4). The exposition of the animals to DEN for 4 h showed a reduction in the CAT and GR activity as 30% and 23%, respectively, compared with to the control. The DEN to induced DNA fragmentation, only after 24 hours of exposition, corresponding to 210, 410 and 610 pair of bases (pb). The activity of the CAT and GR in the animal treated with IAA and exposed to DEN for 4 h did not show significant alteration to compare with the controls. However, the IAA administration was shown a partially protection of the DNA fragmentation from DEN exposition for 24 hours such as 42%, 51% and 48% for the fragments of 210 pb, 54%, 56% and 55% for the fragments of 410 pb and in 51%, 57% and 53% for the fragments of 610 pb by respectively IAA doses 50, 250 and 500 mg/Kg of body weight, compared with the controls. Concluded that the IAA in the doses administered, did not alter the evolution of the body weight, relative percentage of the liver, activity of ALT and AST and liver oxidative stress in animals, suggesting that this auxin is not toxic; and that the IAA promoted the protection of the liver of the animal facing the harmful effects caused by the DEN based in the activity of the CAT and GR activity and DNA fragmentation, showing an antioxidant effect of this auxin.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA09MA035.pdf: 598667 bytes, checksum: ca72444a18cb4ea0606dce41b5264fb9 (MD5) Previous issue date: 2009-01-19 / O uso de sêmen congelado é um pré-requisito para maximizar o ganho genético oriundo da IA em ovinos. Muito embora a IA com sêmen fresco ou resfriado esteja consolidada, com sêmen congelado os resultados são inconsistentes. O uso de plasma seminal (PS) já foi demonstrado como eficaz na proteção e reversão de parte dos danos celulares causados pela criopreservação. Entretanto, o pequeno volume do ejaculado e o risco de transmissão de doenças espécie-específicas são limitações importantes nos ovinos. Uma alternativa a ser considerada é o uso de PS heterólogo, que pela escassez de informações disponíveis, justificam a execução deste estudo, cujos objetivos foram: (a) determinar a capacidade do PS eqüino (PSE) e bovino (PSB) em preservar a viabilidade do sêmen ovino descongelado, comparando-os com o PS ovino (PSO); (b) avaliar o perfil eletroforético das proteínas presentes no PSO, PSE e PSB, e adicionalmente; c) quantificar e comparar o nível de fragmentação do DNA de espermatozóides incubados ou não com PSO, PSE ou PSB. Para tanto, três experimentos foram conduzidos, sendo: Experimento 1: Sêmen descongelado diluído em meio sem PS (SPS) ou contendo 25% de PSO, PSE ou PSB, com exposição por um período de 5 min ou 6 h. Avaliou-se a motilidade, integridade de membrana plasmática e proporção de espermatozóides vivos. No Experimento 2 avaliou-se a concentração protéica total encontrada no PSO, PSE e PSB, bem como o perfil eletroforético das proteínas presentes, mediante SDS-PAGE. No Experimento 3 foi validada uma técnica para a avaliação da integridade do DNA espermático (Neutral Comet Assay - NCA), procedendo-se a avaliação de todos os tratamentos testados nos experimentos anteriores, além dos tratamentos: sêmen descongelado (SD), sêmen fresco (SF) e um controle positivo (CP). Adicionalmente foi avaliado o efeito da técnica de seleção espermática swim up sobre os achados de fragmentação de DNA pelo NCA. A análise estatística foi realizada com o pacote do SAS ou do Minitab, com nível de significância de 5%. Como resultados, observou-se que a exposição por 5 min. em PSO, PSE ou PSB teve efeito benéfico sobre os parâmetros de viabilidade avaliados. A incubação por 6 h reduziu (P<0,05) a motilidade espermática nos tratamentos PSE e PSO, em relação ao SPS e PSB. A integridade de membrana plasmática não foi afetada pelo tratamento. A concentração protéica total no PSO, PSE e PSB foi 16,8, 3,0 e 25,0 &#956;g/&#956;L, respectivamente. O PSO e PSB demonstraram padrões eletroforéticos semelhantes, enquanto o PSE apresentou um perfil distinto. A menor viii fragmentação de DNA com 1 h de incubação foi obtida com o grupo SF, não havendo diferença entre os demais grupos. Com 6 h de incubação, os grupos SPS (63%) e SD (70%) demonstraram maior fragmentação que o tratamento SF (50%), não havendo diferenças entre os tratamentos PSO (60%), PSE (52%) e PSB (55%). Não foi observado efeito da técnica de seleção swim up na fragmentação do DNA, avaliada pelo NCA. Conclui-se que o PS heterólogo pode ser utilizado em substituição ao PSO, mesmo apresentando perfil protéico distinto. Entretanto, a viabilidade espermática foi influenciada pelo tempo de incubação. Em adição, as modificações adotadas no método Neutral Comet Assay possibilitaram sua validação para o sêmen ovino. Por final, o sêmen ovino apresenta uma elevada taxa de fragmentação de DNA, que não difere entre os espermatozóides selecionados ou não pelo método swim up

O ácido indol-3-acético (AIA) é uma auxina natural, metabólito do triptofano, e é produzido em células animal, vegetal e em alguns microrganismos podendo atuar como antioxidante. O objetivo do presente estudo foi o de avaliar o poder antioxidante do AIA, frente a um estresse oxidativo hepático induzido pelo hepatocarcinógeno dietilnitrosoamina (DEN). Foram utilizados camundongos BALB/c com dois meses. Em uma primeira etapa do estudo foram utilizados machos e fêmeas com o propósito de se avaliar somente o efeito do AIA administrado diariamente por 15 dias nas doses de 100, 200 e 500 mg/Kg de peso vivo. Em uma segunda etapa foram utilizados somente machos submetidos ao AIA (50, 250 e 500 mg/Kg de peso vivo) por 15 dias e no 16o dia foram expostos ao DEN por 4 h ou por 24 h. Foram avaliados os seguintes parâmetros: 1) evolução do peso e porcentagem relativa do fígado; 2) alterações metabólicas hepáticas avaliadas pelas atividades de alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase (AST) no soro; 3) perfil oxidativo hepático nas atividades das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa redutase (GR) e dos níveis de glutationa reduzida e glutationa oxidada e 4) fragmentação de DNA hepático. Os resultados foram analisados pela análise de variância (ANOVA) com significância de 0,05 usando o teste de Tukey.O AIA não demonstrou efeito tóxico nas doses utilizadas tanto para machos quanto para fêmeas em nenhum dos parâmetros analisados, pois esses parâmetros não apresentaram diferença significativa em relação aos controles (apenas tampão fosfato salina, pH 7,4). A exposição dos animais ao DEN por 4 h demonstrou diminuição na atividade da CAT e GR em 30% e 23%, respectivamente em relação ao controle. O DEN induziu fragmentação de DNA, somente após 24 horas, correspondentes a 210, 410 e 610 pares de bases (pb). A atividade da CAT e GR nos animais que receberam AIA e expostos ao DEN por 4 h não apresentaram alteração significativa em relação aos controles. Porém, a administração de AIA protegeu, apenas parcialmente o DNA dos efeitos defragmentação causados pela exposição ao DEN por 24 horas, pois se observou uma redução dessa fragmentação em 42%, 51% e 48% para os fragmentos de 210 pb, em 54%, 56% e 55% para os fragmentos de 410 pb e em 51%, 57% e 53% para os fragmentos de 610 pb nos animais que receberam AIA nas respectivas doses de 50, 250 e 500 mg/Kg de peso vivo, em relação aos controles. Concluiu-se que o AIA nas doses administradas, não alterou a evolução do peso, massa relativa do fígado, atividade de ALT e AST e perfil oxidativo hepático dos animais, sugerindo que esta auxina, não é tóxica; e que o AIA promoveu a proteção do fígado dos animais frente aos efeitos deletérios causados pelo DEN, baseado na atividade das enzimas CAT e GR e fragmentação de DNA, demonstrando um efeito antioxidante dessa auxina. / The indol-3-acetic acid (IAA) is a natural auxin, metabolite of the tryptophane, is produced in animal cells, vegetable and in some microorganisms being to act like antioxidant. The objective of the present study was to evaluate the antioxidant effect of the IAA, facing a liver oxidative stress induced by the hepatocarcinogenic diethylnitrosoamine (DEN). Were utilized mice BALB/c with 2 months. In a first phase of the study were utilized males and females with the purpose of to evaluate only the effect of the IAA administered daily by 15 days in the doses of 100, 200 and 500 mg/Kg of body weight. In a second phase were utilized only males submitted to IAA (50, 250 and 500 mg/Kg of body weight) daily during 15 days and in the 16ht day the animals were exposed to the DEN for 4 h or for 24 h. They were evaluated the following parameters: 1) evolution of the weight of the animals and the relative percentage of the liver; 2) liver metabolic alterations evaluated by the activities of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) in the serum; 3) liver oxidative stress available by antioxidant enzyme activity as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) and glutathione reductase (GR) and by levels of the oxidized glutathione and reduced glutathione and 4) fragmentation of liver DNA. The results were analyzed by the analysis of variance (ANOVA) with significance at 0.05 using Tukey test. The IAA did not showed toxic effect in the doses utilized for both males and females for all analyzed parameters, those parameters did not shown significant difference to compare with the controls (only phosphate buffer saline, pH 7.4). The exposition of the animals to DEN for 4 h showed a reduction in the CAT and GR activity as 30% and 23%, respectively, compared with to the control. The DEN to induced DNA fragmentation, only after 24 hours of exposition, corresponding to 210, 410 and 610 pair of bases (pb). The activity of the CAT and GR in the animal treated with IAA and exposed to DEN for 4 h did not show significant alteration to compare with the controls. However, the IAA administration was shown a partially protection of the DNA fragmentation from DEN exposition for 24 hours such as 42%, 51% and 48% for the fragments of 210 pb, 54%, 56% and 55% for the fragments of 410 pb and in 51%, 57% and 53% for the fragments of 610 pb by respectively IAA doses 50, 250 and 500 mg/Kg of body weight, compared with the controls. Concluded that the IAA in the doses administered, did not alter the evolution of the body weight, relative percentage of the liver, activity of ALT and AST and liver oxidative stress in animals, suggesting that this auxin is not toxic; and that the IAA promoted the protection of the liver of the animal facing the harmful effects caused by the DEN based in the activity of the CAT and GR activity and DNA fragmentation, showing an antioxidant effect of this auxin.

A integridade da cromatina espermática é fundamental para a transmissão das informações genéticas paternas, sendo que alterações de DNA podem levar a falhas no processo reprodutivo. Danos na cromatina espermática podem ocorrer por diversos motivos, sendo que os mais importantes são a apoptose, a deficiência de protamina e os danos causados pelas espécies reativas de oxigênio (EROs). Os danos de DNA espermático não impedem que o espermatozóide fecunde o oócito, entretanto podem causar perda embrionária por apoptose. A importância da integridade da cromatina espermática no desenvolvimento embrionário já foi descrita em humanos, sendo que pode ser atribuída como uma das causas de infertilidade masculina, quando está alterada. Contudo, as informações sobre a influência da integridade do DNA espermático no processo de fecundação e do desenvolvimento embrionário na espécie bovina são muito escassas. Devido à falta de informação sobre a relação da fragmentação de DNA e conseqüente alteração nos índices de desenvolvimento embrionário nessa espécie, este trabalho teve como objetivo avaliar o índice de fragmentação de DNA espermático em uma população de touros e verificar a influência dos possíveis danos de DNA espermático na produção in vitro (PIV) de embriões. Para isto, o sêmen congelado de 221 touros foi avaliado pelo ensaio de estrutura de cromatina espermática (SCSA). Após o ensaio, os animais foram divididos em seis grupos experimentais de acordo com o índice de fragmentação de DNA apresentado, sendo sete animais de cada grupo, escolhidos aleatoriamente para as avaliações espermáticas: motilidade, fragmentação de DNA espermático pelos ensaios SCSA e Cometa Alcalino e estresse oxidativo pelo ensaio de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Posteriormente foi realizada a PIV de embriões, sendo avaliados os índices de clivagem e de blastocisto e realizado o ensaio de TUNEL para a avaliação da apoptose dos blastocistos produzidos. Em relação à motilidade espermática, o grupo 1 apresentou menor motilidade em relação ao grupo 4 (p<0,05). Não foi verificada diferença significativa da motilidade entre os outros grupos experimentais. O ensaio SCSA revelou que o grupo 1 apresentou menor susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático quando comparado com o grupo 5 (p< 0,05). O grupo 2 apresentou susceptibilidade à fragmentação de DNA espermático inferior, quando comparado aos grupos 3, 4, 5 e 6 (p<0,05). Em relação ao ensaio Cometa Alcalino, a avaliação do estresse oxidativo e a PIV de embriões, não houve diferença significativa entre os grupos experimentais. Além disso, foi observada correlação negativa entre a intensidade média do Cometa e o índice de blastocisto produzido in vitro. O índice de blastocisto também apresentou correlação negativa com a intensidade média da cabeça do Cometa e ao ensaio TBARS. O ensaio TBARS apresentou correlação negativa com o índice de clivagem dos embriões PIV. Por outro lado, o ensaio TBARS apresentou correlação positiva com os ensaios SCSA e TUNEL. Considerando as condições experimentais, a fragmentação de DNA espermático não influenciou a PIV de embriões bovinos. / Sperm chromatin integrity is essential for the transmission of paternal genetic information. Changes in sperm DNA can lead to failures in the reproductive process. Loss of chromatin integrity may occur for several reasons, and the most important are apoptosis, protamine deficiency and damages caused by reactive oxygen species (ROS). The sperm DNA damage does not prevent the sperm to fertilize the oocyte, however it can cause embryonic loss by apoptosis. The importance of sperm chromatin integrity in embryonic development has been described in humans, and can be considered a cause of male infertility when it is disrupted. However, information on the influence of sperm DNA integrity in the process of fertilization and embryonic development in cattle are very scarce. Due to the lack of information on the relationship between DNA fragmentation and its consequence on embryonic development rates in this species, this study aimed to evaluate the sperm DNA fragmentation rate in a population of bulls and the influence of possible sperm DNA damage on in vitro production (IVP). For this, frozen semen from 221 bulls was evaluated by sperm chromatin structure assay (SCSA). After that, animals were divided into six groups, according to the DNA fragmentation rate observed. Then seven animals from each group were randomly chosen for sperm evaluation: motility, sperm DNA fragmentation by the SCSA and Alkaline Comet assay and oxidative stress by tiobarbituric acid reactive substances (TBARS). After sperm evaluations embryo IVP was performed. Cleavage and blastocyst rates were assessed and the obtained blastocysts were submitted to TUNEL assay for apoptosis evaluation. Regarding sperm motility, group 1 had lower motility compared to group 4 (p <0.05). There was no significant difference in motility between the other experimental groups. The SCSA revealed that group 1 showed lower susceptibility to sperm DNA fragmentation when compared to group 5 (p <0.05). Group 2 was less susceptible to sperm DNA fragmentation, when compared to groups 3, 4, 5 and 6 (p <0.05). For the alkaline comet assay, the assessment of oxidative stress and embryo IVP, no significant difference was shown between en experimental groups. Moreover, there was a negative correlation between the comet mean intensity and the blastocyst rate. The blastocyst rate also negatively correlated to the comet head mean intensity and TBARS. The TBARS was negatively correlated to cleavage rate. In addition, TBARS correlated positively to TUNEL assay and SCSA. Considering the experimental conditions, the sperm DNA fragmentation did not influence the IVP of bovine embryos.

O Ácido Indol Acético (AIA) é um hormônio, denominado auxina e há uma correlação direta entre o efeito citotóxico do AIA e da atividade da peroxidase nas células animais. Os Neutrófilos apresentam uma alta atividade de peroxidase e o AIA gera uma mudança ultra-estrutural e morte destas células em cultura. Entretanto, estudos in vivo mostram que a administração de AIA em baixas doses não promove um efeito prooxidante em neutrófilos e esta suplementação aumenta o englobamento de partículas de Zymosan por estas células. No presente estudo foram avaliados os efeitos da administração do AIA na capacidade fagocitária e na integridade celular de neutrófilos de ratos, observando os seguintes parâmetros: i) capacidade fagocitária – englobamento e morte de Staphylococcus aureus; ii) integridade celular – integridade da membrana plasmática, fragmentação de DNA e potencial transmembrana mitocondrial e iii) atividade de mieloperoxidase. O tratamento aplicado com AIA não apresentou alteração significante na capacidade de englobamento e morte de S. aureus pelos neutrófilos quando aos controles. A integridade celular e atividade de mieloperoxidase nos neutrófilos não foram alteradas pela suplementação com AIA comparadas aos controles. A administração de AIA em baixas doses não mostrou efeito na morte de S. aureus pelos neutrófilos o mesmo também não alterou a integridade celular e a atividade da mieloperoxidase destas células. / Indole acetic acid is (IAA) a hormone termed auxins and there is a direct correlation between the cytotoxic effect of IAA and the peroxidase activity of the animal cells. Neutrophils present a higher peroxidase activity and the IAA leads to marked ultra structural changes and death on these cells in culture. However studies in vivo show that IAA administration at low doses does not promoting a prooxidant effect on neutrophil and this supplementation to increase of the engulfment of Zymosan particles by these cells. In present study were evaluated the effect of IAA administration in the phagocytic capacity and cellular integrity on rat’s neutrophils from the following parameters: i) phagocytic capacity – engulfment and killing of the Staphylococcus aureus; ii) cellular integrity – plasma membrane integrity, DNA fragmentation and mitochondrial transmembrane potential and iii) myeloperoxidase activity. The IAA treatment imposed did not show another significant alteration in the S. aureus engulfment and killing capacity by neutrophils to compare with controls. The cellular integrity and myeloperoxidase activity in the neutrophils did not have alteration by IAA supplementation to compare with the controls. In conclusion the IAA administration at low doses did not show effective action in S. aureus killing by neutrophils and the same time as did not alter the cellular integrity and myeloperoxidase activity by this cell.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / funcionais nos espermatozoides e o nivel seminal de peroxidacao lipidica. Metodo: Um estudo transversal foi realizado incluindo 156 pacientes normozoospermicos. Apos a coleta do semen por masturbacao, uma aliquota foi utilizada para a analise seminal e outra para a avaliacao da atividade mitocondrial, da integridade do acrossoma e da integridade do DNA dos espermatozoides. O volume remanescente de semen foi centrifugado e o plasma seminal sobrenadante foi utilizado para a avaliacao do nivel seminal de peroxidacao lipidica e para a analise proteomica. Posteriormente, os pacientes foram divididos em percentis (15%) para formacao dos grupos experimentais de cada estudo: Estudo 1 - alta (grupo controle) e baixa (grupo alterado) atividade mitocondrial dos espermatozoides, Estudo 2 - alta (grupo controle) e baixa (grupo alterado) integridade do acrossoma dos espermatozoides, Estudo 3 - baixa (grupo controle) e alta (grupo alterado) fragmentacao do DNA dos espermatozoides e Estudo 4 - baixo (grupo controle) e alto (grupo alterado) niveis seminais de peroxidacao lipidica. A analise proteomica foi realizada utilizando LCMS/MS. Os grupos foram comparados por meio de analise univariada (teste t de Student) e analise multivariada (PLS-DA e analise discriminante). As proteinas significantes foram posteriormente submetidas a analise de enriquecimento funcional. Resultados: Nos estudos 1, 2, 3 e 4 foram observadas 506, 493, 474 e 629 proteinas, respectivamente. As funcoes enriquecidas no estudo 1 foram detoxificacao de EROs e ligacao a NADP (controle) e atividade de oxidoredutase intramolecular, catabolismo de aminoglicanos, inibicao de endopeptidases, lisossomos e resposta imune de fase aguda (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 2 foram resposta imune (controle) e inibicao de fosfolipase, metabolismo do acido araquidonico, exocitose, resposta inflamatoria aguda, resposta ao peroxido de hidrogenio e transporte lisossomal (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 3 foram metabolismo de carboidratos, regulacao de lipoproteinas, regulacao negativa da apoptose, metabolismo de hormonios, atividade de metalopeptidases, ligacao ao NAD e lisossomos (controle) e biossintese de prostaglandinas e ligacao a acidos graxos (alterado). As principais funcoes enriquecidas no estudo 4 foram biossintese de acidos graxos insaturados, atividade de oxidantes e antioxidantes e resposta celular ao estresse termico (alterados). Nos estudos 1, 2, 3 e 4 foram sugeridos 8, 6, 8 e 7 biomarcadores seminais de atividade mitocondrial, integridade acrossoma, fragmentacao de DNA e peroxidacao lipidica, respectivamente. Conclusoes: O perfil proteomico do plasma seminal reflete alteracoes funcionais dos espermatozoides e o nivelseminal de peroxidacao lipidica e diversas funcoes pos-genomicas estao relacionadas as alteracoes estudadas. Proteinas relacionadas as alteracoes funcionais dos espermatozoides e ao nivel seminal de peroxidacao lipidica constituem potenciais biomarcadores seminais para cada alteracao / Objective: To verify if the seminal plasma proteomic profile reflects sperm functional alteration and semen lipid peroxidation levels. Method: A cross-sectional study was performed including 156 normozoospermic patients. After semen retrieval by masturbation, an aliquot was utilized for semen analysis and another for evaluation of sperm mitochondrial activity, acrosome integrity and DNA fragmentation. The remaining semen volume was centrifuged and the supernatant seminal plasma was utilized for semen lipid peroxidation levels evaluation, and proteomic analysis. Patients were divided into percentiles (15%) to form the experimental groups: Study 1 – high (control group) and low (altered group) sperm mitochondrial activity; Study 2 – high (control group) and low (altered group) sperm acrosome integrity; Study 3 – low (control group) and high (altered group) sperm DNA fragmentation; Study 4 – low (control group) and high (altered group) semen lipid peroxidation levels. Proteomic analysis was performed by a LC-MS/MS approach. Groups were compared using univariate (Student’s t test) and multivariate (PLS-DA and discrimant analysis) analyses. Differentially expressed proteins were then utilized for functional enrichment analysis. Results: 506, 493, 474, and 629 proteins were observed in studies 1, 2, 3, and 4, respectively. Enriched functions in study 1 were reactive oxygens species detoxification, and NADP binding (control group), and intramolecular oxidoreductase activity, aminoglycans catabolism, endopeptidases inhibition, lysosomes, and acute-phase response (altered group). In study 2, main enriched functions were acute-phase response (control group), and phospholipase inhibition, arachidonic acid metabolism, exocytosis, regulation of acute inflammatory response, response to hydrogen peroxide and lysosomal transport (altered group). In study 3, main enriched functions were carbohydrates metabolism, lipoprotein regulation, negative regulation of apoptosis, hormone metabolism, metalopeptidases activity, NAD binding, and lysosomes (control group), and prostaglandin biosynthesis, and fatty acid binding (altered group). In study 4, enriched functions were unsaturated fatty acid biosynthesis, oxidants and antioxidants activity, and cellular response to heat stress (altered group). In total, 8, 6, 8, and 7 seminal biomarkers were proposed for studies 1 (mitochondrial activity), 2 (acrosome integrity), 3 (DNA fragmentation), and 4 (lipid per oxidation), respectively. Conclusions: The seminal plasma proteomic profile reflects sperm functional alterations and semen lipid perodixation levels, and several post-genomic functions are related to the studied alterations. Proteins related to sperm functional alterations, and semen lipid peroxidation levels constitute potential seminal biomarkers for each alteration. / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: O lúpus eritematoso sistêmico (LES) é uma doença crônica autoimune com predomínio no sexo feminino e com evidente impacto em sua fertilidade. Por sua vez, em homens com LES foi observado alterações nos parâmetros seminais e nos níveis de hormônios sexuais. A análise seminal somente apresenta baixa correlação com potencial de fertilidade dos pacientes. Recentemente, a análise da integridade do DNA do espermatozoide tem mostrado melhor capacidade prognóstica para predizer a fertilidade do que os parâmetros seminais convencionais. Objetivo: Avaliar a fragmentação do DNA espermático de homens com LES sem azoospermia. Métodos: Vinte e oito pacientes homens, consecutivos, com LES (pelos critérios da ACR) e 34 controles foram avaliados conforme dados demográficos e de exposição ambiental, avaliação urológica, perfil hormonal e avaliação seminal (incluindo a fragmentação do DNA espermático). Aspectos clínicos, escores de atividade e dano cumulativo da doença e aspectos do tratamento também foram analisados. Resultados: Mediana da idade [33(20-52) vs. 36.5(25-54) anos, p=0.329] e frequência de varicocele (25% vs. 32%, p=0.183) foram similares entre o grupo de pacientes e o grupo controle. Na análise da fragmentação do DNA do espermatozoide observou-se quantidades significativamente mais altas de células classe III [44(9-88) vs. 16.5(0-80)%,p=0.001] e células classe IV [10.5(3-86) vs. 7(0-36)%,p=0.039] no grupo com LES. O índice de fragmentação do DNA espermático também foi significativamente mais alto em pacientes com LES [62(31-97) vs. 25.5(0-100)%, p < 0.001]. Parâmetros seminais convencionais (incluindo contagem espermática, motilidade e morfologia) foram similares em ambos os grupos. Dentro de grupo de pacientes com LES não foi observada correlação entre o índice de fragmentação do DNA espermático com idade, duração da doença, SLEDAI-2K e SLICC/ACR-DI ou dose cumulativa de predinisona, hidroxicloroquina, metotrexato, azatioprina, micofenolato mofetil ou ciclofosfamida intravenosa (CIC) (p > 0.05). Análises adicionais evidenciaram que motilidade espermática total foi significativamente menor no grupo que fez uso de CIC [64%(15-83) vs. 72%(57-86)%, p=0.024]. O índice de fragmentação do DNA espermático foi semelhante nos dois grupos [52.5(31-95) vs. 67.5(34-97)%, p=0.185]. Conclusões: Homens com SLE sem azoospermia apresentam maior índice de fragmentação do DNA espermático sem alteração dos parâmetros seminais ou hormonal. CIC não parece ter papel significativo nesta alteração. Estudos prospectivos futuros são necessários para determinar o impacto desta alteração na fertilidade destes pacientes / Introduction: Systemic lupus erythematosus (SLE) is a chronic autoimmune disease with a female predominance and have clear impact on fertility. In male SLE has been shown to alter seminal parameters and sexual hormonal levels. Recently, sperm DNA integrity analysis has shown better prognostic performance to predicting male fertility than seminal parameters. Objective: To evaluate sperm DNA fragmentation in non-azoospermic male SLE patients. Methods: Twenty-eight consecutive male SLE patients (ACR criteria) and 34 healthy controls were evaluated for demographic/exposures data, urologic evaluation, hormone profile and seminal analysis (including sperm DNA fragmentation). Clinical features, disease activity/damage scores and treatment were also assessed. Results: Median age [33(20-52) vs. 36.5(25-54) years, p=0.329] and frequency of varicocele (25% vs. 32%, p=0.183) were similar in SLE patients and healthy controls. Sperm DNA fragmentation showed significantly higher levels of cells class III [44(9-88) vs. 16.5(0-80)%, p=0.001] and cell class IV [10.5(3-86) vs. 7(0-36)%,p=0.039] in SLE. Sperm DNA fragmentation Index was also significantly higher in SLE patients [62(31-97) vs. 25.5(0-100)%, p < 0.001]. Conventional sperm parameters (including sperm count, motility and morphology) were similar in both groups. In SLE patients no correlations were observed between sperm DNA fragmentation index with age, disease duration, SLEDAI-2K and SLICC/ACR-DI scores, and cumulative dose of prednisone, hydroxychloroquine, intravenous cyclophosphamide (IVCYC), methotrexate, azathioprine and mycophenolate mofetil (p > 0.05). Further analysis of SLE patients treated with and without IVCYC showed that total sperm motility was significantly lower in the former group [64%(15-83) vs. 72%(57-86)%, p=0.024]. Sperm DNA fragmentation index was alike in both groups [52.5(31-95) vs. 67.5(34-97)%, p=0.185]. Conclusions: To our knowledge, this is the first demonstration that male non-azoospermic SLE patients have increased sperm DNA fragmentation without evident gonadal dysfunction. IVCYC does not seem to be a major determinant for this abnormality. Future prospective study is necessary to determine the impact of this alteration in these patients\' fertility

INTRODUÇÃO: A prevalência global da obesidade duplicou desde 1980, alcançando mais de 600 milhões de adultos obesos em 2014. Em paralelo a este aumento, alguns autores relataram uma tendência mundial de declínio da concentração de espermatozoides no ejaculado nas últimas décadas. Consequentemente, surge a hipótese da relação entre esses dois fatos temporais. Dentre todas as formas de tratamento da obesidade, a cirurgia bariátrica é a que apresenta melhores resultados em termos de perda de peso e melhor efetividade a longo-prazo. Há evidências na literatura que sugerem que a obesidade é capaz de alterar os níveis dos hormônios reprodutivos e função erétil. No entanto, seus efeitos sobre os parâmetros seminais clássicos e no índice de fragmentação do DNA espermático (IFD) são pouco estabelecidos. Além disso, o impacto da cirurgia bariátrica sobre estas alterações ainda não foi devidamente esclarecido. OBJETIVO: Identificar os efeitos da obesidade sobre a função erétil, hormônios reprodutivos, função testicular e IFD de homens obesos. Adicionalmente, avaliar se a cirurgia bariátrica é capaz de afetar estes mesmos parâmetros. MÉTODOS: Este estudo foi organizado em duas fases. Na primeira fase, indivíduos com índice de massa corpórea (IMC) menor que 30 kg/m2 e fertilidade comprovada foram comparados a pacientes obesos em programação para cirurgia bariátrica, com IMC maior que 35 kg/m2. Todos os pacientes foram submetidos a dosagem de hormônios reprodutivos, análise seminal e aferição do IFD pelo método do cometa alcalino. O questionário do Índice Internacional de Função Erétil (IIEF-5) foi aplicado. Na segunda fase, parte dos indivíduos obesos foi submetida à cirurgia bariátrica e todos foram convocados para reavaliação em 6 meses. RESULTADOS: Homens obesos apresentam maiores níveis séricos de estradiol, LH e FSH, e menores níveis séricos de testosterona total (TT) quando comparados com homens férteis eutróficos. Além disso, apresentam piores parâmetros seminais, com redução do volume ejaculado, concentração seminal, número total de espermatozoides no ejaculado, motilidade total, motilidade progressiva e percentual de espermatozoides com morfologia normal, e elevação do IFD. Na fase 2, homens obesos submetido a cirurgia bariátrica apresentaram elevação dos valores de FSH, SHBG, TT e testosterona livre (TL), e redução dos níveis de prolactina sérica. Além disso, apresentam queda da concentração seminal e do número total de espermatozoides no ejaculado, e queda na fragmentação do DNA espermático. Controles obesos, por outro lado, não apresentaram alterações nas variáveis estudadas. Além disso, maior intensidade da perda de peso esteve associada com alterações mais importantes do número total de espermatozoides no ejaculado, e dos níveis séricos de TT, TL, SHBG e FSH. CONCLUSÕES: A obesidade é capaz de induzir alterações importantes dos hormônios reprodutivos, parâmetros seminais e IFD. A cirurgia bariátrica, entretanto, pode reverter os efeitos deletérios sobre os hormônios reprodutivos e fragmentação do DNA, mas pode trazer piora de parâmetros seminais em 6 meses de seguimento / INTRODUCTION: Worldwide obesity prevalence has duplicated since 1980, reaching more than 600 million obese adults in 2014. Parallel to this increase, several authors have reported a global tendency of ejaculated sperm concentration decline in the last decades. Therefore, comes to light the hypothesis that these two temporal trends are related. Among all forms of obesity treatments, the one that reaches the best results and long-term effectiveness is the bariatric surgery. Growing evidence in the literature suggests that obesity is capable of altering reproductive hormones levels and erectile function. Effects on classic semen parameters and DNA fragmentation index (DFI), however, have not been properly established. OBJECTIVE: Determine the effects of obesity over erectile function, reproductive hormones, testicular function, and DFI in obese men. Additionally, evaluate if bariatric surgery can also impact those parameters. METHODS: This study was divided into two phases. On the first phase, individuals with body mass index (BMI) lower than 30 kg/m2 and proven fertility were compared to obese men, with BMI higher than 35 kg/m2, waiting to be submitted to bariatric surgery. Reproductive hormones evaluation, semen analysis and evaluation of DFI by the alkaline comet assay were performed in all patients. The International Index of Erectile Function (IIEF-5) was used to assess erectile function. On phase two, part of the obese patients was submitted to bariatric surgery, and all were invited to 6-month revaluation. RESULTS: Obese men have higher blood levels of estradiol, LH and FSH, and lower levels of total testosterone (TT) when compared to eutrophic fertile men. Additionally, they present worse semen parameters, with a reduction in ejaculated volume, sperm concentration, total number of sperm in the ejaculate, total motility, progressive motility, and percentage of normal sperm, and higher sperm DFI. On phase two, obese men submitted to bariatric surgery showed higher FSH, SHBG, TT, and free testosterone (FT) levels, and reduction of blood prolactin levels. Moreover, they exhibited a reduction in sperm concentration and total ejaculated sperm count, and a reduction in sperm DNA fragmentation. Obese controls, however, did not experience changes in the studied variables. Finally, the intensity of weight loss was associated with greater changes in total ejaculated sperm count and in TT, TL, SHBG and FSH blood levels. CONCLUSIONS: Obesity can induce important changes in reproductive hormones, semen parameters, and DFI. Bariatric surgery, however, can revert the deleterious effects in reproductive hormones and DFI, but can result in worsening of semen parameters on 6-month follow-up

A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermática / Human semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motility

A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermática / Human semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motility